и ее сторонники отметили, что эксперименты Чжана не приносили плодов до июня 2012 года именно потому, что он не до конца понимал, какую роль в процессе играет tracгРНК [185].
Сам Чжан в статье, которую они с коллегами в конце концов опубликовали в январе 2013 года, судя по всему, признал, что в полной мере разобрался в том, какую функцию выполняет tracгРНК, только после ознакомления с работой Даудны и Шарпантье. Он отметил, что “ранее было показано”, что tracгРНК необходима для разрезания ДНК, и дал ссылку на статью Даудны и Шарпантье. “Фэн знал, что необходимы две этих РНК, поскольку прочитал нашу статью, – говорит Даудна. – В статье Фэна 2013 года он ссылается на нас и цитирует нас именно по этой причине”.
Когда я спросил об этом Чжана, он сказал, что сделал сноску, поскольку так было принято, ведь все функции tracгРНК впервые были описаны как раз в статье Даудны и Шарпантье. Но и он сам, и Институт Брода утверждают, что он уже экспериментировал с системами, связывающими tracгРНК и cгРНК [186].
Разобраться в этом непросто. Насколько я могу судить, Чжан изучал возможность применения CRISPR для редактирования генома человека с 2011 года. К середине 2012 года он сосредоточился на системе Cas9 и добился некоторых успехов по обеспечению ее работы, но успехи эти были скромными. Тем не менее нет однозначных доказательств – и точно нет опубликованных свидетельств, – что он в полной мере изучил ключевые компоненты системы и понимал, какие функции выполняет tracгРНК, пока не прочитал статью Даудны и Шарпантье, опубликованную в июне 2012 года.
Чжан не скрывал одной вещи, которую узнал из работы Даудны и Шарпантье: только прочитав статью, он узнал, что существует способ объединить cгРНК и tracгРНК и создать одиночную направляющую РНК, которую можно запрограммировать на распознавание нужной ДНК-последовательности. “Мы адаптировали гибрид cгРНК и tracгРНК, недавно испытанный in vitro”, – написал он позже, сославшись на статью Даудны и Шарпантье. Марраффини, который по-прежнему работал с Чжаном в июне 2012 года, подтверждает его слова: “Мы с Фэном начали использовать одиночную направляющую РНК только после того, как прочитали статью Дженнифер”.
Как отмечает Чжан, создание одиночной направляющей РНК было полезным, однако не принципиально важным изобретением. Система CRISPR-Cas9 может работать, если оставить tracгРНК и cгРНК отдельными элементами, а не объединить их в одну, более простую молекулу, как сделала команда Даудны и Шарпантье. Одиночная направляющая РНК упрощает систему и облегчает ее внедрение в клетки человека, но работу системы обеспечивает не она [187].
Глава 25. Даудна вступает в гонку
“У нас не было специалистов по редактированию генома”
Удивительно, что Дженнифер Даудна вообще участвовала в конкурентной борьбе за право раньше остальных обеспечить работу CRISPR-Cas9 в организме человека. Она никогда не экспериментировала с клетками человека и никогда не конструировала инструменты для редактирования генома, такие как TALEN. Опыта в этой сфере не было и у ее ведущего исследователя Мартина Йинека. “В моей лаборатории работало много биохимиков, специалистов по кристаллографии и подобным вещам, – говорит она. – Но экспертов по созданию культивированных человеческих клеток и даже клеток круглого червя у нас не было”. В связи с этим тот факт, что Даудна вступила в борьбу, хоть и знала, что многие будут пытаться создать на основе их открытий о CRISPR-Cas9 инструмент, работающий в клетках человека, свидетельствует о ее готовности идти на риск.
Даудна правильно поняла, что использование CRISPR для редактирования генома человека станет следующим прорывом. Она решила, что другие исследователи, включая Эрика Сонтхаймера и, вероятно, сотрудников Института Брода, стремятся как можно быстрее достичь цели, и захотела вступить с ними в конкуренцию. “После нашей июньской статьи я поняла, что нужно ускориться, но наши соавторы, казалось, об этом и не думали, – вспоминает она. – Это меня удручало. Я стремлюсь везде быть первой”. Она подталкивала Йинека работать активнее. “Ты должен сделать это своей задачей номер один, – твердила она, – потому что если Cas9 станет надежной технологией для редактирования генома человека, то мир изменится”. Йинек боялся, что выполнить задачу будет нелегко. “У нас не было специалистов по редактированию генома в отличие от некоторых лабораторий, где работали пионеры этого метода, – говорит он, – и потому нам приходилось заново изобретать то, что другие уже сделали” [188].
Александра Ист
Позже Даудна признала, что сначала пережила “множество провалов”, пытаясь наладить работу CRISPR-Cas9 в клетках человека [189]. Но когда начался осенний семестр 2012 года, а Чжан ускорил работу, чтобы быстрее закончить собственные эксперименты, ей улыбнулась удача. В лабораторию пришла новая студентка Александра Ист, которая имела опыт работы с клетками человека. Особенно любопытной была ее подготовка: она училась редактировать геном, когда была лаборанткой в Институте Брода, где работала с Фэном Чжаном и другими исследователями.
Ист сумела вырастить необходимые человеческие клетки и начала эксперименты по внедрению Cas9 в их ядра. Получив первые результаты, она не смогла однозначно сказать, свидетельствуют ли данные о том, что происходит редактирование генома. Порой результаты биологических экспериментов оказываются неочевидными. Но Даудна, у которой глаз был наметан, сочла эксперименты успешными. “Когда [Александра] показала мне данные, мне сразу стало ясно, что ей удалось получить прекрасные свидетельства редактирования генома в клетках человека с помощью Cas9, – говорит Даудна. – Этим студент, не завершивший обучение, отличается от человека вроде меня, который уже некоторое время работает в своей сфере. Я знала, что именно хочу увидеть, и стоило мне взглянуть на полученные ею данные, как что-то щелкнуло и я подумала: «Да, у нее получилось». Она сомневалась в этом и подозревала, что ей придется провести эксперименты снова, но я сказала: «О боже, это же здорово! Это просто замечательно!»” [190]
По мнению Даудны, данные свидетельствовали, что обеспечение работы CRISPR-Cas9 в клетках человека нельзя считать ни серьезным прорывом, ни новым изобретением: “Было хорошо известно, что можно пометить белки сигналами ядерной локализации, чтобы направить их в ядро, и именно так мы поступили с Cas9. Кроме того, было известно, как изменить кодоны в гене, чтобы белок лучше экспрессировался в клетках млекопитающих, и это мы тоже сделали”. Ей казалось, что в этом не было ничего особенно нового, хотя она и спешила первой достичь поставленной цели. Чтобы поместить ферменты в ядро клетки, достаточно было адаптировать методы, которые использовались ранее, например TALEN. Ист добилась этого за несколько месяцев. “Когда стало понятно, из каких компонентов состоит система, сложностей уже
