Белки, РНК и ДНК являются полимерами, а секвенирование любого биологического полимера представляет собой серьезный вызов: реакция должна отсекать каждый из мономеров родительского полимера в определенном порядке. Секвенирование же ДНК имело еще одну дополнительную сложность, поскольку этот полимер имеет двойную структуру, и, хотя можно было секвенировать однонитевую РНК, основы ее химизма неприменимы к ДНК непосредственно.
Рис. 37. Кодоновое колесо – Розеттский камень, указывающий, как индивидуальные основания, или нуклеотиды, в составе ДНК кодируют конкретные аминокислоты в белке. Код каждой аминокислоты содержится в последовательности из трех нуклеотидов, которая называется кодоном. Двигаясь от центра колеса наружу, можно определить, какая аминокислота закодирована каждой из последовательностей ДНК. Например, последовательность AGC кодирует аминокислоту серин, а последовательность ACC – треонин. Для всех аминокислот, за исключением метионина и триптофана, существует более одного возможного кодона
За эту проблему брались несколько ученых-химиков, первым среди которых был Фредерик Сэнгер, английский биохимик из Кембриджского университета, уже получивший в 1958 году Нобелевскую премию по химии за разработку методики секвенирования белков. Сэнгер и его коллеги разработали метод секвенирования ДНК, предполагавший вначале разделение двух нитей и затем химическое разбиение последовательности в случайном порядке, на любом из четырех нуклеотидов в цепочке. После этого было необходимо найти молекулярную массу того, что осталось после химической реакции. Молекулярная масса продуктов определялась посредством отделения каждого из них согласно размеру в большом объеме геля. Через гель пропускался электрический ток, ввиду чего разрезанные кусочки ДНК были принуждены двигаться через гель. Самые маленькие кусочки двигались быстрее и, следовательно, дальше, чем более крупные; измеряя, насколько далеко продвинулся тот или иной кусочек, можно было вычислить, какой нуклеотид оказался на первом месте, какой – на втором, третьем и так далее. Применив эту методику, Сэнгер и его коллеги смогли секвенировать вирус PhiX174, содержащий 5375 нуклеотидов.
Их работа, опубликованная в 1977 году, была первой в истории записью геномной последовательности ДНК. Метод Сэнгера в конце концов привел к появлению технологии, позволившей секвенировать геном человека. В 1980 году Сэнгер получил вторую в своей жизни Нобелевскую премию по химии, разделив ее с Уолтером Гилбертом, независимо от него открывшим другой, несколько более трудоемкий метод секвенирования ДНК. Был и третий участник, разделивший с ними премию, – Пол Берг, биохимик из Стэнфордского университета, открывший процесс создания молекул ДНК из двух или более источников – молекул, не существующих в природе. Такие рукотворные молекулы ДНК называются рекомбинантной ДНК. Открытия этих трех ученых изменили мир не меньше, а, вероятно, даже больше, чем открытие структуры ДНК.
Разработанная Сэнгером базовая методика секвенирования посредством «обрыва цепи» не могла применяться к длинным последовательностям ДНК. Для того чтобы подступиться к проблеме секвенирования человеческого генома, содержащего 23 хромосомы, ДНК следовало разрезать на более мелкие куски. Отдельные куски уже можно было секвенировать, после чего перекрывающиеся случайные последовательности сверялись и по ним реконструировался весь геном. Этот метод, которому было дано название «метод дробовика» (термин, предложенный самим Сэнгером), был вначале разработан для микроорганизмов, а затем его применил к человеческому геному Дж. Крейг Вентер с коллегами. В самом деле, если технические аспекты секвенирования были сами по себе достаточно сложны, то реконструирование порядка генов в каждой хромосоме представляло собой еще более трудную задачу. Эта работа, на завершение которой ушло несколько лет, показала, что наш геном содержит более 3,2 млрд пар оснований, но лишь около 1,5 % из них кодируют белки. Это был один из самых больших сюрпризов, преподнесенных проектом по секвенированию человеческого генома, – у нас, оказывается, всего лишь около 20 тысяч генов, кодирующих белок, – гораздо меньше, чем предсказывалось до того, как геном был секвенирован, и всего лишь на один-два порядка больше, чем у обычных червей. Таким образом, более 97 % нашего генома содержат некодирующие области, которых нет у микроорганизмов.
Как ни парадоксально, секвенирование человеческого генома раскрыло, как относительно небольшие генетические изменения могут привести к более высокой организационной структуре животного. Важнейшие инструкции по сборке механизмов, снабжающих нас энергией и обеспечивающих синтез белков, транспортировку ионов и основной метаболизм, – все опираются на генетические платформы, унаследованные от микроорганизмов и сложившиеся миллиарды лет тому назад.
Благодаря материальной поддержке, оказанной министерством энергетики проекту по секвенированию человеческого генома, появилась возможность вкладывать крупные суммы в создание аппаратуры, которая позволила бы автоматизировать процесс секвенирования ДНК. Действительно, для меня и моих коллег в Ратгерском университете секвенирование генома является повседневной работой, и стоимость этой операции невообразимо мала. Когда Сэнгер впервые начал секвенировать ДНК, она составляла около 75 центов за нуклеотид, а к 2014 году упала до менее чем 0,001 цента. В 2002 году, когда проект «Геном человека» находился на стадии разработки, было определено, что стоимость секвенирования человеческого генома составит 100 млн долларов; сейчас эта цифра приближается к 1000 долларов и почти наверняка еще более снизится в ближайшие годы.
Невероятному снижению стоимости секвенирования содействовало огромное увеличение мощности компьютерной техники и взаимосвязанности компьютеров. Используя Интернет, последовательности ДНК теперь можно пересылать в реальном времени, так что подбор наилучшего соответствия с уже секвенированными молекулами ДНК занимает миллисекунды, и для только что расшифрованной последовательности сразу может быть определена ее вероятная функция внутри клетки.
С возросшими способностями компьютерной техники пришли более эффективные и дешевые технологии секвенирования и новые алгоритмы поиска генов. Фактически технологии стали настолько дешевыми, а аппаратура – настолько распространенной, что в национальных лабораториях США образовались избыточные мощности. Этот избыток мощностей секвенирования вскоре стремительно распространился по всему миру – на Францию, Германию, Великобританию, Китай, Японию, Корею и Индию. Как его использовать?
Вскоре после того, как проект «Геном человека» начал воплощаться в жизнь, Дэвид Галас, возглавлявший эту программу в министерстве энергетики в Вашингтоне, посетил Брукхэвенскую национальную лабораторию, чтобы узнать, чем занимаются тамошние биологи. Директор лаборатории попросил меня подготовить короткую презентацию, посвященную моей работе по выяснению механизма, позволяющего определенному виду одноклеточных водорослей синтезировать большее или меньшее количество определенных белков в ответ на изменение освещения – феномен, чрезвычайно важный для океанического фитопланктона. Галас спросил, не соглашусь ли я провести встречу, чтобы рассмотреть вопрос о том, как новые технологии секвенирования и компьютерные технологии могут применяться для изучения распределения микроорганизмов в окружающей среде. Я с радостью принял это предложение.
На заседании, где присутствовало около шестидесяти моих коллег из разных частей страны, я выступил с обстоятельным докладом. В конечном счете мы пришли к массовому секвенированию ДНК микроорганизмов в океанах, почвах, воздухе, озерах, горных породах, ледниках – практически во всех возможных местах обитания. В результате геномные последовательности океанических микроорганизмов анализируются с немыслимой скоростью; уже идентифицированы десятки миллионов новых генов. По существу эта информация представляет собой сокровищницу нетронутого биологического потенциала, который может быть мобилизован с целью выполнения любых поставленных нами задач в области генной инженерии микроорганизмов.
Буквально одним щелчком электронного прибора последовательность гена или множества генов – да что там, целого генома – может быть переслана через весь мир для анализа, переформирования и перераспределения. Едва ли не любой из генов может быть синтезирован и внедрен в микроорганизм. Такой свободный обмен генными функциями не знает границ; он привел к дальнейшему наращиванию войны с микроорганизмами.
