Именно тогда на Дону возникали первые временные казачьи поселения, их «зимовища и юрты», в которых они могли поселить свои семьи. Постепенно на месте некоторых из них возникли огороженные простейшими укреплениями (рвом, валом с тыном) «городки». В них казаки укрывались во время внезапного нападения татар, хранили припасы и вооружение. Первые достоверные сведения о казачьих городках относятся к 40-м гг. XVI в. В 1548 г. упоминается «острога», которую атаманы Михаил Черкашенин и Истома Извольский поставили на «Великом Перевозе» (Переволоке). Кроме этого укрепленного поселения на Дону существовало 3 или 4 «города», в которых атаманствовал Сары-Азман, возможно на «запольных» реках находились и другие казачьи поселения. Н. А. Мининков высказал предположение о существовании еще одного казачьего центра на Нижнем Дону, однако в дошедших до нас документах он не упоминается.
Московские власти не контролировали «польских» казаков, признавая тот факт, что «те разбойники живут на Дону без нашего ведома, а от нас бегают». Численность их росла. На Дон шли не только рязанские «заполяне», но и вольница из Северской земли и даже западнорусских земель. В донесении путивльского наместника Троекурова, направленном в 1546 г. в Москву, сообщалось о том, что «ныне казаков на Поле много, и черкасцов, и кыян, и твоих государевых — вышли, государь, на Поле из всех украин». К середине XVI в. казаки освоили донские и приднепровские степи и начали тревожить татар в их улусах. С нескрываемой тревогой о действиях донцов в 1551 г. писал ногайскому князю Исмаилу турецкий султан Сулейман I, по словам которого, «казаки с Озова оброк емлют и воды на Дону пить не дадут. А крымскому де царю потому ж обиды чинят великие». Перечисляя их, султан упоминает и не отраженный в русских источниках казачий набег на Перекоп.
Первый известный поход против Крыма донские казаки совершили в 1556 г. Войско во главе с атаманом Михаилом Черкашенином, возглавлявшим казаков, живших на Северском Донце, на стругах по реке Миус спустилось в Азовское море, пересекло его и разорило окрестности Керчи. Двух захваченных во время похода «языков» (татарина и турка) казаки прислали в Москву.
Приток русского населения на Дон возрос в конце XVI в. в связи с усилением податного гнета в центральных областях Русского государства, разоренного Ливонской войной и опричниной. Среди уходивших на Дон людей было немало преступников, бежавших из Московского государства от заслуженного наказания. Им на руку был старинный обычай казаков не выдавать беглых русскому правительству. «И быв на Дону хотя одну неделю или месяц, — писал Котошихин, — а лучитца им с чем-нибудь приехать к Москве, и до них впред дела никакова ни в чем не бывает никому, что кто ни своровал, потому что Доном от всяких бед свобождаютца». Эта традиция оказалась живучей и сохранилась до времен Петра I.
Правительство, стремясь унять казачьи разбои и использовать их военный опыт для борьбы с татарской угрозой, стало привлекать вольных казаков к государственной пограничной службе. Как пограничная стража служилые казаки раньше всего появились на южных «украйнах», где существовала постоянная опасность вражеского нападения. Они сыграли очень важную роль при реорганизации в 1571 г. сторожевой и станичной службы, заменив отряды детей боярских, которые были возвращены в полковую службу.
До середины XVI в вольные казаки не включались в состав русского войска, однако их действия в южнорусских степях становились все более заметными. Игнорировать это обстоятельство московские власти не могли. Наличие общего врага сближало интересы Москвы с донским и запорожским казачеством.
Эпизодические контакты правительства с донскими казаками начались в конце 40 — начале 50-х годов XVI в., а в 70-е гг. приобрели постоянный характер. В немалой степени этому способствовало то, что по Дону шли все дипломатические и торговые сношения Русского государства с Крымом и Турцией. В то время донское казачество еще не имело единой войсковой организации, поэтому для обеспечения безопасности этого пути правительству приходилось контактировать с выборными властями отдельных юртов и отрядов, размещавшихся по берегам рек бассейна Дона.
Первое упоминание о «приборе» донских казаков на московскую службу относится к 1549 г. Направив к ногайцам посла Ивана Федулова, царь Иван Васильевич предлагал им начать совместные действия против Крыма, сообщая, что уже «велел казакам своим путивльским и донским крымские улусы воевати и недружбу царю делати».
В том же 1549 г. несшие службу в степи «великого князя казакы Урачко с товарыщи» перехватили казанских послов, везших в Крым сообщение о смерти хана Сафа-Гирея. В 1550 г. донские казаки участвовали в боях с ногайцами под Рязанью. В конце 1550-х гг. они включались в состав русских войск, несших службу «на Поле». В источниках сохранилось упоминание о том, что из донских казаков состоял отряд головы Юрия Булгакова, в 1557 г. разбивший на реке Айдар татар, шедших в набег к русской границе («под украйну»). Захваченных в бою «языков» привели в Москву казачьи атаманы Елка и Лопырь. Донские и волжские казаки участвовали в борьбе с ногайцами, в составе московских армий завоевывали Казань и Астрахань, бились на полях сражений Ливонской войны, несли службу в пограничных русских крепостях, получая за службу кормовое, а иногда и поместное жалованье.
Помимо дозорной и походной службы правительство прибегало к помощи казаков для охраны посольств и торговых караванов, обещая им жалованье, главным образом, сукнами, селитрой и свинцом, в которых казаки очень нуждались. Для успешного выполнения таких поручений атаманам разрешалось «прибирать» на «донскую службу» даже северских служилых людей, за которыми сохранялись их поместья.
Еще одним центром вольного казачества после завоевания Казани и Астрахани являлась Волга, куда донцы переходили с Дона и в поисках добычи спускались на своих судах в Каспийское море. Объектом их нападений становились торговые караваны и ногайские кочевья. В официальных бумагах того времени сохранились имена казачьих предводителей, разбойничавших на Волге: Василий Мещерский и Пичуга Путивлец. Первоначально правительство пыталось договориться с волжскими казаками миром. В 1557 г. на Волгу был направлен атаман Ляпун Филимонов, пользовавшийся полным доверием Москвы со времени покорения Астрахани. Он получил наказ предпринять меры, «чтоб казаки не воровали и на ногайские улусы не приходили». Казаки не послушались Филимонова и, убив атамана, напали на шедший вниз по Волге торговый караван и разграбили его. Расхищенной оказалась и государева казна, отправленная тогда в Астрахань. Это нападение стало первым зафиксированным в документах выступлением казаков против русского правительства. Оставить его без последствий московские власти не могли. На Волгу направили войска, включавшие дворянские сотни, стрельцов и отряды служилых казаков во главе с атаманами А. Ершовым, Б. Губиным и Д. Хохловым. Принятые правительством меры несколько разрядили обстановку. Английский посол Э. Дженкинсон, побывавший в этих краях вскоре после описанных событий отметил, что место у Переволоки ранее представляла опасность «из-за воров и разбойников; однако в настоящее время, вследствие завоеваний русского царя, оно не так страшно».
Однако полностью очистить Волгу от казаков не удалось и вскоре нападения возобновились. Об одном из них известно со слов англичан Томаса Бэннистера и Джона Дэкета, корабль которых, направлявшийся из Ширвана в Астрахань, был атакован и захвачен казаками. Астраханский воевода выслал против разбойников 500 воинов на 40 лодках, а затем подкрепление еще на 60 лодках. В результате большого сражения разбойники были разбиты, многие из них погибли, другие бежали. В 1581 г. правительственные войска на Волге разгромили еще один казачий отряд. Возглавлявший его атаман Митя Бритоус был взят в плен и повешен.
Вынужденные покинуть Волгу, казаки вернулись на Дон, но часть их двинулись за Волгу. В конце июня — начале июля 1581 г. отряд атамана Нечая напал на ногайцев, разорив их столицу Сарайчик, располагавшуюся в низовьях реки Яик (Урал), положив тем самым начало яицкому казачеству. Окончательно казаки утвердились на Яике в 1586 г., поставив на Кош-Яицком острове напротив устья реки Илек постоянный городок. Ногайцы попытались уничтожить казачью крепость, долго осаждая ее, но, потерпев поражение, вынуждены были отступить. К концу XVI в. казачьи городки находились по всему Яику. С 1591 г. уральские казаки служили в рядах русского войска. Власть московского царя яицкие казаки признали при Михаиле Федоровиче, а до этого, по их воспоминаниям, «жили…немалое время своевольно, ни под чьею державою». Подобно донцам, яицкие казаки первоначально жили небольшими общинами, образовавшимися вокруг городков. Единая казачья область (Войско) возникла на Яике в 50-е гг. XVII в. В воинском искусстве яицкие казаки не уступали донцам, поддерживая с ними тесную связь, получая оттуда пополнения и помощь, а в случае необходимость и укрытие. В 1636–1637 гг. в донском городке Голубые проживал Иван Яковлевич Поленов, который в 1636 г. был есаулом в войске яицких казаков, взявших персидский город Фарабад.
