В последнее время разработан и успешно применен комбинированный метод трансформации, названный агролистическим. Он основан на объединении баллистического и агробактериального способов и заключается во введении в геном растения каким-либо физическим методом (в большинстве случаев баллистическим) чужеродной ДНК, включающей агробактериальные гены.
Конечный этап — получение трансгенных растений, как правило, преодолевается легче, чем предыдущие процедуры. Благодаря тому, что многие клетки растений тотипотентны, то есть из любой единичной клетки может вырасти целое плодоносящее растение, трансгенные растения получают из трансформированных клеток.
Культивирование растений с модифицированным геномом включает несколько серий пересевов на селективных средах. Длительность регенерации трансформированных растений достигает нескольких месяцев, причем все это время они находятся в среде с высокими концентрациями селективных веществ. Как правило, применяются маркерные гены двух основных типов — селективные и репортерные. Селективные придают растениям устойчивость к антибиотикам или гербицидам, позволяя трансформированным растениям расти в условиях действия селективных агентов. Репортерные гены детерминируют синтез нейтральных для клеток белков, наличие которых в тканях может быть легко установлено. При получении генетически модифицированного растения, устойчивого к пестицидам, ген устойчивости выступает как в роли целевого, так и селективного гена.
Присутствие маркерных генов, особенно устойчивых к антибиотикам, служит одним из главных доводов против использования трансгенных продуктов. Потому-то и был разработан и теперь активно применяется ряд методических подходов, обеспечивающих элиминацию маркерного гена, когда фактически он уже не нужен.
После получения целого трансгенного растения проводится анализ геномной ДНК растений, направленный на то, чтобы определить присутствие целевого гена. Он проводится различными путями. В большинстве случаев это достаточно сложные и дорогостоящие лабораторные методы, например, ПЦР-анализ, рестрикционный анализ и др. Заключительная стадия лабораторного тестирования ГМ растений включает биологические исследования, направленные на подтверждение стабильного фенотипического проявления целевого признака.
С использованием описанных выше подходов к настоящему времени в мире созданы и доведены до испытаний в полевых условиях ГМ формы сельскохозяйственных растений, относящиеся более чем к 50 видам. Так, получены трансгенные формы томатов (более 260), сои (более 200), хлопчатника (более 150), тыквенных растений (более 80), табака (более 80), а также пшеницы, риса, подсолнечника, огурцов, салата, яблонь и других (более 70). Из них значительную часть представляют растения, устойчивые к насекомым-вредителям и гербицидам.
Большинство производящихся в настоящее время в промышленных объемах ГМ сельскохозяйственных растений (или растений первого поколения) имеют свойства, обеспечивающие повышение урожайности или облегчение уборки, хранения, переработки урожая. Эти качества позволяют снизить применение гербицидов и инсектицидов, что оказывает положительное влияние на окружающую среду, сократить количество технологических операций при переработке, а также уменьшить потери урожая, повысить качество продукции, сэкономить средства и материальные ресурсы.
Прикладные ДНК-технологии: достижения и перспективы
Основные задачи современной селекции
Рассматривая возможности современной селекции и генетической инженерии, Жученко (2003) определяет принципиально новые приоритеты самой селекции растений, вытекающие из их современного понимания:
• роли интегрированности генома у высших эукариот, проявляющейся в формировании блоков коадаптированных генов и сохранении их status quo при передаче наследственной информации от одного поколения другому;
• необходимости перехода от управления изменчивостью моногенных признаков к комбинаторике количественных (полигенных) признаков, многие из которых относятся к хозяйственно ценным;
• первостепенной роли мейотической рекомбинации (а не мутаций) в формировании потенциальной, свободной и доступной отбору генетической изменчивости у цветковых растений;
• роли абиотических и биотических факторов внешней среды, определяющих не только направление и темпы естественного отбора («формирующее») влияние биоценотической среды), но и выступающих в качестве индукторов генетической изменчивости (мутационной, рекомбинационной, репарационной, транспозиционной);
• необходимости сочетания в сортах и гибридах высокой потенциальной продуктивности, устойчивости к действию абиотических и биотических стрессоров, а также продукционных и средообразующих (почвоулучшающих, фитомелиоративных, фитосанитарных, ресурсовосстанавливающих, эстетических и др.) функций;
• важности развития новых направлений селекции, включая фито- и биоценотическое, биоэнергетическое, экотипическое, экологическое, симбиотическое, а также апомиктическое, гаметное (гаплоидия позволяет фиксировать последствия мейотической рекомбинации, а апомиксис, связанный с полиплоидией, используется для уменьшения зависимости продуктивности растений от неблагоприятных условий внешней среды.) и др.;
• возможности использования «доместикационного синдрома» с целью введения в культуру новых видов и экотипов растений (экологическая и экотипическая селекция).
Человечеству требуется все больше продуктов питания и промышленного сырья, получаемого из растений. Поэтому усовершенствование растений, предназначенных для использования в сельскохозяйственном производстве, сейчас является наиболее интенсивно развивающейся областью применения ДНК-технологий. Традиционная селекция имеет существенное ограничение. Ее приемы позволяют получать гибриды только родственных растений. Скрещивать картофель разных сортов можно, но растения разных видов (за редчайшими исключениями) нельзя, например нельзя получить гибрид сливы и яблони. Ветви древа жизни, пройдя долгий эволюционный путь, разошлись друг от друга очень далеко. Их развитие долго шло независимо. Потому-то разные виды не «переплетаются» меж собой. И нельзя скрестить кошку с собакой, человека с обезьяной. И хотя есть мул, гибрид осла и лошади, он бесплоден, так же как и гибрид льва с тигрицей.
Природа воздвигла между далекими видами непреодолимый барьер, который мешает селекционной работе. Фактически селекционеры тасуют одни и те же гены. Селекционерам удалось получить гибрид капусты и редьки, но, к их глубочайшему разочарованию он имел корни капусты, а ботву — редьки! А вот ДНК-технологи — генные инженеры — почти с первой попытки смогли сотворить гибрид свеклы со шпинатом и, если потребуется, смогут вырастить все что угодно и на заказ.
В США и Канаде гибридами ГМ рапса заняты большие площади. Такие сорта важны и для Восточной Европы, где использование рапсового масла могло бы оказаться очень перспективным. Добавление всего 1% этого масла к дизельному топливу значительно уменьшает загрязнение окружающей среды соединениями серы, которых особенно много в выхлопах дизельных двигателей. Кроме того, это яркий пример по сути безотходного (индустриального) сельского хозяйства — рапсовое масло используют в промышленности, а жмых идет на корм скоту.
Появилась возможность создавать съедобные сорняки. Биоинженерия меняет не только растения, но и наши представления о них. Возможно, что завтра, вместо того чтобы ломать голову, как избавиться от сорняков, мы будем их есть.
ГМ растения, устойчивые к насекомым-вредителям
В процессе получения ГМО с помощью трансгеноза первостепенное внимание должно быть уделено повышению устойчивости сортов и гибридов к болезням, вредителям и сорнякам. О важности этого направления селекции свидетельствует уже тот факт, что общее число потенциально вредоносных для агроэкосистем видов достигает 80-100 тыс., в том числе свыше 30 тыс. возбудителей грибных, бактериальных и вирусных заболеваний, около 10 тыс. членистоногих и др. Несмотря на увеличение количества применяемых в сельском хозяйстве пестицидов (например, в США — 400 тыс. т в год), к началу XXI столетия потери урожая составляют в среднем 33%. Общая же цена потерь урожая сельскохозяйственных растений в мире, согласно имеющимся оценкам, только от болезней достигает 50 триллионов долларов в год.
Одним из факторов риска в получении высоких и стабильных урожаев является поражение посевов насекомыми. Так, например, ущерб от поражения посевов кукурузы кукурузным мотыльком (Ostrinia nubialis) в США составляет около миллиарда долларов в год. А тысячи тонн инсектицидов, расходуемых ежегодно, естественно, не очень полезны окружающей среде.
