У дрозофилы химеры создаются при инъекции эмбриональных ядер одной линии мух в оплодотворенное яйцо другой линии, имеющее свои ядра. Судьба инъецированных ядер зависит от места их введения. На заднем конце яйца они становятся половыми клетками. В других частях яйца они попадают в ту или иную область поверхностной цитоплазмы и соответственно образуют клетки, входящие в состав тканей личинки или взрослой мухи. При этом они сохраняют отличительные особенности своей генетической линии. Сходный результат получают и при инъекции в яйцо ядер из некоторых многократно перевиваемых культур клеток дрозофилы, но половые клетки при этом не образуются. Очень важно, что при некоторых обстоятельствах клетки еще не теряют способности к дифференцировке, но уже не могут образовать половые клетки. Это заставляет взглянуть на зародышевый путь не как на полезную абстракцию, а как на определенную реальность.
В этой главе мы старались показать, как различные способы гибридизации создают комбинации двух генотипов и цитоплазмы или комбинации клеток с разными генотипами. Возможности, которые открывают эти методические подходы, еще не исчерпаны, и работа в этих направлениях (особенно с соматическими гибридами и с химерами) активно продолжается. Гибридизация животных и растений уже привела к огромным практическим достижениям в получении новых пород и сортов. Можно ожидать, что и методы «клеточной инженерии» дадут не только важные теоретические, но и чисто практические результаты.
Слияние ранних зародышей приводит к появлению аллофенных мышей (химер)
Эмбрионы мышей разных линий (например, с черной и белой окраской) на стадии восьми клеток извлекают из материнских организмов, освобождают от оболочек и сближают. При этом образуется один зародыш смешанного происхождения. Его пересаживают в третью мышь — «мать-воспитательницу», которая и рождает химерных мышат
Глава VIII
Манипуляции с молекулами
В предыдущих главах мы неоднократно говорили о роли ДНК, о функции генов, о синтезе РНК как о первом этапе реализации генетической информации. Почти во всех случаях об этих молекулярных процессах судят, не видя самих молекул, фактически не дотрагиваясь до них. В лучшем случае синтез РНК или белка определяют по скорости включения в эти вещества их радиоактивных предшественников — нуклеотидов или аминокислот. В этой главе речь пойдет об опытах, Которые проводят почти исключительно в пробирках с чистыми препаратами ДНК и РНК, выделенными из клеток. Если исследование скорости синтеза макромолекул фактически заканчивается их выделением, то в работах, которые мы здесь обсудим, исследования с этого только начинаются.
При нагревании ДНК выше 80–90° водородные связи, соединяющие комплементарные пары нуклеотидов друг с другом, разрываются и двойная спираль ДНК распадается на две одиночные нити. Это называется денатурацией ДНК. Если теперь несколько понизить температуру раствора и поддерживать ее такой достаточное время (это называется отжиг), то водородные связи между отдельными комплементарными основаниями (А и Т, Г и Ц) будут возникать снова. Однако устойчивая двойная спираль ДНК образуется лишь в том случае, если эти связи восстановятся на достаточно большом протяжении молекулы, т. е. если случайно встретятся две одиночные нити, комплементарные друг другу. Это называется ренатурацией ДНК.
Ренатурация происходит с тем большей скоростью, чем выше в растворе концентрация комплементарных друг другу отрезков ДНК. Поэтому если ренатурация происходит быстро, то данная последовательность ДНК представлена в геноме большим числом копий. И наоборот, если какая-то последовательность нуклеотидов редка и составляет лишь небольшую долю всей ДНК, то и случайная встреча двух таких комплементарных нитей происходит редко, а ренатурация такой уникальной ДНК будет идти очень медленно. Так, по скорости ренатурации можно судить о том, как часто представлены в геноме те или иные гены.
Одиночная нить ДНК может связываться водородными связями и с комплементарной ей нитью РНК, образуя гибридную ДНК-РНКовую молекулу. Естественно, что комплементарными ДНК могут быть только те РНК, которые ранее были транскрибированы с нее или с точно такой же ДНК. Это позволяет исследовать, какая часть ДНК участвует в синтезе РНК и, наоборот, какие виды РНК присутствуют в клетке на разных стадиях развития или в разных тканях организма.
Манипуляции с молекулами нуклеиновых кислот стали особенно разнообразными и эффективными после того, как появились методы генной инженерии. С их помощью удалось обнаружить в эмбриональных клетках слабую активность многих тысяч генов, которые до того считались «молчащими», а также подсчитать количество копий различных мРНК, и в том числе мРНК для некоторых отдельных белков. Эти данные заставляют сейчас по-новому пересмотреть многие, казалось бы уже устоявшиеся, представления.
Для исследования ренатурации ДНК ее предварительно разрезают на небольшие куски, но 300–600 пар нуклеотидов, денатурируют нагреванием, а затем подвергают длительному отжигу при температуре 70–80°, при которой случайные короткие комплементарные последовательности распадаются, а ренатурируют лишь большие комплементарные участки ДНК, фактически те самые, которые оказались разделенными при денатурации.
Ренатурация ДНК вирусов происходит очень быстро. Так как скорость ренатурации зависит от концентрации ДНК (C0), то точнее говорить, что для вирусной ДНК низко произведение концентрации на время ренатурации (C0t). Это и понятно, так как количество генов в геноме вирусов мало (порядка сотни) и вероятность одиночной нити ДНК «найти» «свою» вторую половину достаточно велика. Ренатурация ДНК бактерий происходит значительно дольше — число различных генов и, следовательно, число различных последовательностей ДНК в этом случае выше в десятки раз.
Казалось, можно было предсказать, что ренатурация ДНК животных должна идти еще намного медленнее (величина C0t должна быть выше). Однако фактически это не совсем так. Определенная часть ДНК (около 10 %) ренатурирует очень быстро, как у вирусов или еще быстрее. Еще некоторая, иногда значительная часть ДНК ренатурирует тоже довольно быстро, хотя и медленнее, чем у вирусов и бактерий. И лишь остальные 50–70 % ДНК (иногда меньше) ренатурируют так медленно, как это и ожидалось (C0t в 103 раз выше, чем для ДНК бактерий).
Объяснение этому факту — в том, что часть ДНК в геноме животных и растений состоит из повторяющихся последовательностей ДНК. Действительно, если какие-либо гены повторяются сотни или тысячи раз, то их концентрация в растворе соответственно возрастает и скорость их ренатурации будет выше, чем для генов, которые уникальны, т. е. представлены в геноме только один раз. He все повторяющиеся последовательности являются настоящими генами, т. е. несут информацию о структуре белка. Так, особенно высоко повторяющиеся последовательности (104—105 раз на геном) состоят из одинаковых коротких, идущих друг за другом (тандемных) участков и находятся на концах хромосом и в тех точках, к которым прикрепляются нити веретена при митозе. Очевидно, что эти ДНК служат не для кодирования белков, а выполняют в хромосоме какую-то механическую роль.
Среди умеренных повторов (102-103 раз) роль некоторых известна; Это прежде всего те участки ДНК, которые кодируют РНК для белоксинтезирующей машины. Хотяэти участки ДНК и не кодируют белки, но их тоже часто называют генами. Так, гены больших рРНК (18S и 28S) повторяются от нескольких десятков раз у насекомых до тысяч раз у отдельных рыб и амфибий.
Еще чаще повторяются гены для маленького компонента рибосомной РНК — 5S РНК: у ксенопуса их 24 000, а у человека 2000. Наконец, гены для транспортных РНК(их более 40 видов) также повторяются сотни и тысячи раз, но для разных видов тРНК число этих повторов различно.
Смысл таких повторов для генов рРНК и тРНК, очевидно, состоит в том, чтобы обеспечить достаточное количество рибосом и скорость трансляции на них в тех клетках, где синтез белка особенно интенсивен. В первую очередь это относится к ооцитам, в которых гены больших рРНК еще и амплифицируются (гл. 2).
Оказалось, что повторяются, хотя и не в такой степени, и некоторые настоящие гены, кодирующие белки. В наибольшей степени это относится к генам гистонов: в хромосомах морского ежа каждый из них повторяется несколько сот раз. Гены многих других белков повторяются два— четыре раза.
Эти повторы в ДНК создают определенную проблему для понимания процессов эволюции. С одной стороны они должны замедлять течение эволюции. Случайная мутация, затронувшая один из повторяющихся генов, в принципе не должна подвергаться действию отбора. Так, например, мутация в одном из генов рРНК или в одном из гистоповых генов окажет очень небольшое полезное или вредное влияние на работу рибосом или ядер: ведь вся остальная, подавляющая масса рРНК или гистонов окажется неизменной. Ho если это так, то с течением времени такие «неотбираемые» мутации должны накапливаться в геноме и создавать все большие отличия между ранее одинаковыми генами. Ho в действительности таких различий нет или очень мало. Отсюда возникли предположения, которые уже нашли некоторые фактические подтверждения, о том, что в клетках существует какой-то механизм коррекции, который исправляет постоянно возникающие отличия между повторами или скорее заменяет каждый набор повторяющихся генов точными копиями одного из них. Тогда в эволюции естественный отбор сохранит лишь те организмы, у которых гены рРНК или гистонов остались неизменными пли стали «лучше», чем были.
