Однако принцип обогащения кДНК неприменим для тех белков человека, количество которых очень мало или место синтеза которых неизвестно. В этом случае могут понадобиться другие экспериментальные подходы. Например, интерфероны (ИФ) человека, включающие альфа, бета- и гамма-интерфероны, — это природные белки, каждый из которых может найти свое терапевтическое применение. Первый ген интерферона был выделен в начале 80-х г.г. XX века. С тех пор было обнаружено несколько разных интерферонов. Полипептид, обладающий действием лейкоцитарного интерферона человека, синтезирован в E.coli.
Некоторые особенности интерферона сделали выделение его кДНК особенно сложным. Во-первых, несмотря на то что интерферон был очищен более чем в 80 ООО раз, его удавалось получать лишь в очень небольших количествах, т.к. в то время не была известна его точная молекулярная масса. Во-вторых, в отличие от многих других белков, интерферон не обладает легко идентифицируемой химической или биологической активностью: ее оценивали только по снижению цитопатического действия вируса животных на культуру клеток, а это сложный и длительный процесс. В-третьих, в отличие от инсулина, было неизвестно, есть ли клетки человека, способные вырабатывать интерферон в достаточно больших количествах, т.е. существует ли источник мРНК интерферона. Несмотря на все эти трудности, в конце концов была выделена и охарактеризована кДНК, кодирующая интерферон. При выделении их кДНК пришлось разработать специальный подход, позволяющий преодолеть трудности, связанные с недостаточным содержанием соответствующих мРНК и белков. Теперь такая процедура выделения ДНК обычна и стандартна и для интерферонов состоит в следующем.
1. Из лейкоцитов человека выделили мРНК и фракционировали ее по размерам; провели обратную транскрипцию и встроили в сайт Psti плазмиды pBR322.
2. Полученным продуктом трансформировали Escherichia соli. Образовавшиеся клонов подразделили на группы. Тестирование проводили на фуппе клонов, что позволило ускорить процесс их идентификации.
3. Каждую фуппу клонов гибридизовали с неочищенным препаратом ИФ-мРНК.
4. Из образовавшихся гибридов, содержащих клонированную ДНК и мРНК, выделили мРНК и провели ее трансляцию в бесклеточной системе синтеза белка.
5. Определили имтерфероикую противовирусную активность каждой смеси, полученной в результате трансляции. Группы, проявившие интерферонную активность, содержали клон с кДНК, гибридизовавшейся с ИФ-мРНК.
6. Позитивные группы разбили на подгруппы, содержащие по несколько клонов, и вновь провели тестирование. Разбиение на подгруппы повторяли до тех пор, пока не идентифицировали клон, содержащий полноразмерную ИФ-кДНК человека.
С тех пор было обнаружено несколько разных типов интерферонов. Были выделены гены нескольких интерферонов и показана их эффективность при лечении различных вирусных заболеваний, но, к сожалению, интерферон не стал панацеей.
Исходя из химических и биологических свойств интерферона, можно выделить три фуппы: ИФ-альфа, ИФ-бета и ИФ-гамма. ИФ-альфа и ИФ-бета синтезируются клетками, обработанными препаратами вирусов или вирусной РНК, а ИФ-гамма вырабатывается в ответ на действие веществ, стимулирующих рост клеток. ИФ-альфа кодируется семейством генов, включающим как минимум 15 неаллельных генов, в то время как ИФ-бета и ИФ-гамма кодируются одним геном каждый. Подтипы ИФ-альфа проявляют разную специфичность. Например, при проверке эффективности ИФ-эльфа-1 и ИФ-альфа-2 на обработанной вирусом линии клеток быка эти интерфероны проявляют сходную противовирусную активность, в случае же обработанных вирусом клеток человека ИФ-альфа-2 оказывается в семь раз активнее, чем ИФ-альфа-1. Если противовирусная активность проверяется на клетках мыши, то ИФ-альфа-2 оказывается в 30 раз менее эффективным, чем ИФ-альфа-1.
В связи с тем, что существует семейство интерферонов, было предпринято несколько попыток создать ИФ с комбинированными свойствами, используя тот факт, что разные члены семейства ИФ-альфа различаются по степени и специфичности своей противовирусной активности. Теоретически этого можно достичь, соединив части последовательностей генов разных ИФ-альфа. Это приведет к образованию гибридного белка с другими свойствами, чем у каждого из исходных белков. Сравнение последовательностей кДНК ИФ-альфа-1 и ИФ-альфа-2, показало, что они содержат одинаковые сайты рестрикции в позициях 60, 92 и 150. После расщепления обеих кДНК в этих сайтах и последующего лигирования фрагментов было получено несколько гибридных генов. Эти гены экспрессировали в E.coli, синтезированные белки очистили и исследовали их биологические функции. Проверка защитных свойств гибридных ИФ на культуре клеток млекопитающих показала, что некоторые из них проявляют большую активность, чем родительские молекулы. Кроме того, многие гибридные ИФ индуцировали образование 2'-5'-олигоизоаденилат-синтетазы в контрольных клетках. Этот фермент участвует в синтезе 2'-5'-связанных олигонуклеотидов, которые в свою очередь активируют латентную клеточную эндорибонуклеазу, расщепляющую вирусную мРНК. Другие гибридные ИФ проявляли большую, чем родительские молекулы, антипролиферативную активность в культурах различных раковых клеток человека.
Стратегию конструирования новых белков путем замены функциональных доменов или с помощью направленного мутагенеза можно использовать для усиления или ослабления биологического свойства белка. Например, нативный гормон роста человека (ГРЧ) связывается в разных типах клеток как с рецептором гормона роста, так и с пролактиновым рецептором. Чтобы избежать нежелательных побочных эффектов в процессе лечения, нужно исключить присоединение ГРЧ к пролактиновому рецептору. Поскольку участок молекулы гормона роста, связывающийся с этим рецептором, по своей аминокислотной последовательности лишь частично совпадает с участком молекулы, который взаимодействует с пролактиновым рецептором, удалось избирательно снизить связывание гормона с последним. Для этого использовали сайт-специфический мутагенез, в результате которого произошли определенные изменения в боковых группах некоторых аминокислот (His-18, His-21 и Glu-174) — лигандов для ионов Zn2+, необходимых для высокоаффинного связывания ГРЧ с пролактиновым рецептором. Модифицированный гормон роста связывается только со «своим» рецептором. Полученные результаты представляют несомненный интерес, но смогут ли модифицированные ГРЧ найти применение в клинике, пока неясно.
Наиболее частым летальным наследственным заболеванием среди европеоидов является муковисцидоз. В США выявлено 30 ООО случаев этого заболевания, в Канаде и странах Европы — 23 000. Пациенты с муковисцидозом часто страдают инфекционными заболеваниями, поражающими легкие. Лечение рецидивирующих инфекций антибиотиками в конце концов приводит к появлению резистентных штаммов патогенных бактерий. Бактерии и продукты их лизиса вызывают накопление в легких вязкой слизи, затрудняющей дыхание. Одним из компонентов слизи является высокомолекулярная ДНК, которая высвобождается из бактериальных клеток при лизисе. Ученые из биотехнологической компании Genentech (США) выделили и экспреccировали ген ДНКазы — фермента, который расщепляет высокомолекулярную ДНК на более короткие фрагменты. Очищенный фермент вводят в составе аэрозоля в легкие больных муковисцидозом, он расщепляет ДНК, вязкость слизи снижается, что облегчает дыхание. Хотя эти меры и не излечивают муковисцидоз, они облегчают состояние больного. Применение данного фермента было недавно одобрено Департаментом по контролю качества пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (США), и объем его продаж составил в 2000 г. примерно 100 млн. долларов.
Другой биотехнологический продукт, помогающий больным — альгинат-лиаза. Альгинат — это полисахарид, синтезируемый целым рядом морских водорослей, а также почвенными и морскими бактериями. Его мономерными единицами являются два сахарида — бета-D-маннуронат и альфа-1-гулуронат, относительное содержание и распределение которых и определяют свойства конкретного альгината. Так, остатки a-L-гулуроната образуют межцепочечные и внутрицепочечные сшивки путем связывания ионов кальция; остатки бета-D-маннуроната связывают ионы других металлов. Альгинат, содержащий такие сшивки, образует эластичный гель, вязкость которого прямо пропорциональна размеру полисахаридных молекул.
Выделение альгината слизистыми штаммами Pseudomonas aeruginosa существенно повышает вязкость слизи у больных муковисцидозом. Чтобы очистить дыхательные пути и облегчить состояние больных, в дополнение к обработке ДНКазой следует провести деполимеризацию альгината с помощью альгинат-лиазы.
