Кстати, вы обратили внимание на то, что окислительные ферменты особенно активны в готовящихся к росту или растущих органах растений — в донце луковицы и ее корешках, в ростках клубней картофеля? Обмен веществ идет там наиболее интенсивно.
Итак, мы выяснили, что не всякие условия среды благоприятны для действия ферментов. Если сильный нагрев инактивирует ферменты, то, может быть, они более активны при низкой температуре? Проверим и это. Для опыта нужны будут дополнительно четыре стеклянные или металлические банки емкостью около одного литра и лед или снег (примерно 1 кг). Опыт поставим с капустной кочерыжкой.
Натрите кочерыжку на терке, сок, как и прежде, отожмите через марлю или ткань и разбавьте водой в двадцать раз. Пронумеруйте вновь пробирки, если старая нумерация почему-либо стерлась, и налейте в пробирки 1, 2, 3 и 4 по 1 мл разбавленного капустного сока, а затем добавьте гидрохинон на кончике ножа. В пробирки 5 и 6 вместо сока налейте по 1 мл воды и тоже насыпьте гидрохинон. А затем расставьте пробирки следующим образом: 1 — в банку со снегом или льдом; 2 — в банку с теплой водой (40 °C); 3 — в банку с горячей водой (60 °C); 4 — оставьте на столе при комнатной температуре; 5 — в банку с кипящей водой; 6 — оставьте при комнатной температуре.
Через 5 мин после начала опыта во все пробирки, начиная с более холодных, влейте по пять капель пероксида водорода. Смесь осторожно взболтайте и заметьте время начала реакции. Еще через 5 мин выньте пробирки из банок и запишите результаты опыта в виде таблицы, примерно такой же, как и в прошлый раз. Когда таблица заполнена, можно заняться анализом полученных данных.
Попробуйте сделать выводы самостоятельно, ответив сначала на следующие вопросы.
Ускоряется ли реакция окисления при повышении температуры без добавления фермента?
Можно ли сказать, что ферменты лучше действу' ют при охлаждении?
Какая температура наиболее благоприятна для действия пероксидаз?
Почему пищевые продукты дольше сохраняются в холодильнике?
Для чего кипятят молоко?
Почему теплокровные животные — млекопитающие и птицы — наиболее развитые и жизнеспособные животные на Земле?
Вы ответили на все эти вопросы? Тогда — наши пояснения.
Вы, вероятно, заметили, что скорость окисления гидрохинона пероксидом водорода неодинакова при низкой и высокой температурах. При высокой температуре скорость окисления, естественно, выше. Пероксидазы облегчают взаимодействие гидрохинона с пероксидом. В присутствии фермента реакция проходит даже при низкой температуре, однако чем выше температура, тем легче ферменту активировать молекулы реагирующих веществ.
Но нельзя забывать, что белки при высокой температуре свертываются, скорость реакции снижается. Существует понятие оптимальной температуры действия ферментов, при которой они проявляют наибольшую активность. Для разных ферментов эта температура неодинакова, но многие ферменты, в том числе и пероксидазы, имеют температурный оптимум 40–50 °C.
Пищевые продукты портятся под действием ферментов, которые содержатся в них или выделяются микроорганизмами. На холоде активность ферментов снижается — вот почему в холодильнике продукты портятся меньше.
На верхнюю ступень эволюции поднялись теплокровные животные, которые могут поддерживать температуру тела, оптимальную для деятельности ферментов.
ОПЫТЫ С ФЕРМЕНТАМИ: ДЕГИДРОГЕНАЗЫ
До сих пор вы ставили опыты с растительными тканями. Попробуем поэкспериментировать с ферментами из тканей животных. Объект нового исследования — дегидрогеназы, которые участвуют в процессах тканевого дыхания у животных. Из названия этих ферментов видно, что они отнимают у веществ атомы водорода. Как это происходит, вы увидите чуть позже, а пока приготовьте все необходимое для опыта.
На этот раз вам понадобятся следующие вещества: 5 мл 0,5 %-ного водного раствора формальдегида (аптечный формалин разбавить водой в десять раз); столько же 0,02 %-ного водного раствора метиленового синего (можно использовать разбавленные синие чернила); столько же водного раствора янтарной кислоты, осторожно нейтрализованного пищевой содой до прекращения выделения пузырьков; 10 мл вазелинового или растительного масла. Еще нужен будет термометр и объекты исследования — свежее коровье молоко и мясо курицы или кролика.
Сначала посмотрим, как окисляет формальдегид дегидрогеназа свежего молока. Чтобы это стало заметно, и понадобился раствор красителя метиленового синего: дегидрогеназа отнимет у формальдегида атом водорода, перенесет его на легко восстанавливающийся краситель, и он обесцветится. А формальдегид окислится при этом до муравьиной кислоты. Обесцвеченный после восстановления краситель легко окисляется кислородом воздуха и вновь синеет. Поэтому реакционную смесь придется изолировать от воздуха слоем масла.
Пронумеруйте шесть пробирок. В пробирки 1 и 2 налейте по 5 мл свежего некипяченого молока, а в пробирку 3 — такое же количество холодного кипяченого молока.
Воду в водяной бане нагрейте до 37 °C. Во все три пробирки добавьте по 0,5 мл (около 50 капель) раствора формальдегида и по 5 капель раствора метиленового синего. Смесь станет голубой. В каждый флакон налейте немного масла, чтобы образовался тонкий изолирующий слой на поверхности, и поставьте пробирки 1 и 3 на водяную баню. Пробирку 2 оставьте при комнатной температуре. Заметьте время начала реакции и наблюдайте за изменением окраски растворов. Результаты не забудьте записать в тетрадь.
Как и раньше, зададим вам наводящие вопросы. При какой температуре раствор обесцвечивается быстрее?
Сохраняет ли фермент свою активность в кипяченом молоке?
Что произойдет, если продуть через обесцвеченный раствор воздух?
Прежде чем проверить правильность своих выводов, поставьте еще один опыт с дегидрогеназой, а потом уже рассмотрим результаты обоих опытов.
В мышцах животных содержится специфический фермент — дегидрогеназа янтарной кислоты. Она катализирует превращение янтарной кислоты в фумаровую с переносом отнятого водорода на подходящее вещество, например, на метиленозый синий. Эта реакция протекает без участия кислорода, как говорят, в анаэробных условиях.
Сырое мясо курицы или кролика (около 10 г) мелко нарежьте и разотрите на блюдце. Кашицу промойте несколько раз водой на марле, чтобы удалить растворимые вещества. Промытую кашицу размешайте с тройным объемом воды, в которую добавлена поваренная соль — примерно треть чайной ложки. Разбавленную кашицу влейте в пробирки 4, 5 è 6 — по 5 мл в каждую. Пробирку 4 погрузите на пять минут в кипящую водяную баню и охладите до комнатной температуры. Затем в пробирки 4 и 5 добавьте по 0,5 мл раствора янтарной кислоты и по 10 капель раствора метиленового синего, а в пробирку 6 добавьте 0,5 мл воды и 10 капель красителя. В каждый флакон долейте чуть-чуть масла, чтобы изолировать смесь от воздуха. Проследив изменение окраски, попробуйте ответить на очередные вопросы.
Восстанавливается ли краситель в присутствии прокипяченной кашицы из мяса?
Нужна ли для этой реакции янтарная кислота?
Сходно ли поведение ферментов из тканей при высокой температуре?
А теперь — пояснения. Дегидрогеназы в свежем молоке ускоряют реакцию окисления формальдегида (это замечено по обесцвечиванию метиленового синего). Восстановленному красителю можно вернуть синий цвет, окисляя его кислородом воздуха. Дегидрогеназа молока при низкой температуре «работает» медленно; после кипячения молока она вовсе теряет активность. Значит, у этого фермента тоже есть оптимальная температура реакции.
В опытах с кашицей из мышц дегидрогеназа янтарной кислоты, как и все ферменты, теряет активность после кипячения. В отсутствие янтарной кислоты реакция также не идет (если вы хорошо промыли кашицу водой и удалили таким образом содержащуюся в ней янтарную кислоту). Фермент довольно быстро окисляет янтарную кислоту до фумаровой, перенося атомы водорода на краситель.
И еще один опыт с этим же ферментом, но с другим объектом — с микроорганизмами. До сих пор вы имели дело с животными и растительными тканями. Однако микроорганизмы, пожалуй, еще лучше вооружены ферментами: ведь у них нет других средств борьбы за существование, кроме биохимических. С одним из микроорганизмов, а точнее — грибов, мы и поставим опыт. Речь идет об обычных пекарских дрожжах. Среди множества активных ферментов, которые вырабатываются дрожжами, есть и знакомая нам дегидрогеназа.
Кусочек прессованных дрожжей разотрите на блюдце с двумя чанными ложками кипяченой воды. Растирать лучше пластмассовой или алюминиевой ложкой. Когда смесь станет однородной, внесите ее чистой пипеткой в две пробирки. Их надо предварительно вымыть с мылом ватным тампоном на палочке, промыть водой и высушить. Другой пипеткой добавьте в обе пробирки немного масла.
