Обнаружение антигена с помощью ИФМ и РИМ
Первый этап – адсорбция специфических антител твердой фазой, в качестве которой обычно используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых микротитраторных панелей. Антитела нековалентно связываются со стенками лунок, у них сохраняются свободными активные центры, и поэтому они способны специфически реагировать с соответствующим антигеном.
Второй этап – связывание антигена из суспензии исследуемого материала за счет реакции антитело + антиген, происходящей на границе твердая фаза – жидкость. После этого луночки промывают раствором, содержащим слабый неионный детергент, для удаления из системы других, неспецифически связанных с антителами компонентов.
Третий этап – обработка твердой фазы с фиксированными на ней комплексами антитело + антиген специфическими антителами против данного антигена, но меченными либо ферментом, либо изотопом. Такие меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется из системы промыванием. Таким образом, в случае присутствия в исследуемом материале искомого антигена на поверхности твердой фазы формируется комплекс: антитело + антиген + меченое антитело. Результаты реакции учитывают в зависимости от характера метки. Для иммуноферментного метода антитела метят ферментом, чаще всего пероксидазой или щелочной фосфатазой. Субстратом для пероксидазы служит H2O2 в смеси с ортофенилендиамином, используемая в виде раствора в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0). Добавление в опытную луночку раствора субстрата приводит к тому, что он подвергается действию пероксидазы, фиксированной на антителах; образующиеся продукты реакции имеют желтую окраску, интенсивность которой может быть определена путем фотометрирования.
Радиоиммунный метод (РИМ) предусматривает использование антител, меченных изотопом, поэтому результаты реакции оценивают путем определения радиоактивности исследуемых образцов. При положительной реакции уровень радиоактивности опытных образцов более чем в 2 раза превышает уровень радиоактивности контрольных, заведомо отрицательных образцов (рис. 75, а).
Рис. 75. Схема использования иммуноферментного и радиоиммунного методов для обнаружения антигенов (а) и антител (б):
1. Поверхность твердой фазы. 2. Специфические антитела. 3. Антиген (исследуемый материал). 4. Cпецифические к данному антигену антитела, меченные ферментом (5) или изотопом (6). 7. Субстрат для фермента. 8. Специфический антиген. 9. Исследуемая сыворотка (антитела). 10. Антивидовая сыворотка, содержащая антитела к человеческому иммуноглобулину, меченные ферментом (11) или изотопом (12). 13. Субстрат для фермента
Обнаружение специфических антител с помощью ИФМ и РИМ
Для обнаружения антител реакции также ставят в три этапа.
Первый этап – адсорбция специфических антигенов на стенках луночек. Обычно планшеты в коммерческих тест-системах уже имеют сенсибилизированные луночки, т. е. на их дне и стенках антигены уже адсорбированы.
Второй этап – добавление в луночки образцов исследуемой сыворотки для обнаружения в ней специфических антител к данному антигену. Если они имеются, то вступают во взаимодействие с антигеном и образуют комплекс антиген + + антитело.
Третий этап – после отмывания луночек в них добавляют специфические антиглобулиновые антитела (антивидовые, т. е. антитела против человеческих иммуноглобулинов), но меченные ферментом (ИФМ) либо изотопом (РИМ). Результаты реакции оценивают, как указано выше (рис. 75, б). В качестве контроля используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные.
Предложены различные варианты иммуноферментного метода. Большое значение имеет вариант ИФМ, позволяющий осуществлять «захват» антител, относящихся к IgM. Этот метод позволяет более точно производить серологическую диагностику, так как основан на обнаружении специфических иммуноглобулинов IgM, которые появляются в первую очередь при встрече с возбудителем.
Этот тип иммунологических реакций основан на способности антител специфически подавлять (нейтрализовать) биологическую активность возбудителя или его токсинов в различных тест-системах – организме животных, в куриных эмбрионах, культурах клеток – или каким-то иным способом. Это зависит от природы возбудителя и цели исследования. Например, для оценки эффективности иммунизации против дифтерии и столбняка определяют уровни антитоксинов в сыворотке крови привитых по их способности нейтрализовать биологическое действие определенной дозы токсина (реакция Шика). Однако реакции нейтрализации применяют и с диагностическими целями. Особенно широкое применение они получили в вирусологической практике как для серологической диагностики вирусных заболеваний, так и для идентификации вирусов. С этой целью используют реакции нейтрализации роста вирусов в культуре ткани, подавления бляшкообразования, гемадсорбции, торможения гемагглютинации (РТГА) и др.
Таблица 18
Активность антител, относящихся к различным классам иммуноглобулинов, в иммунологических реакциях
До тех пор, пока не была выяснена химическая природа антител, полагали, что каждая реакция иммунной сыворотки опосредуется особым видом антител, которые получили соответственно название агглютининов, преципитинов, опсонинов, антитоксинов и т. п. Хотя эти названия сохранились, они имеют чисто феноменологическое значение, т. е. отражают конечный результат взаимодействия антитела с антигеном. В настоящее время уже ясно, что нет специальных антител – агглютининов, преципитинов и т. д., а есть 5 классов иммуноглобулинов. Специфичность антител, относящихся к любому классу иммуноглобулинов, определяется структурой активного центра, причем антитела данной специфичности могут относиться к разным классам. Конечный исход взаимодействия антигена с антителами зависит от природы антигена (корпускулярный – агглютинация, растворимый – преципитация); от участия системы комплемента (бактериолиз, бактерицидное действие); макрофагов; от того, к какому классу иммуноглобулинов относится данное антитело; от свойств его Fc-фрагмента. Разные классы иммуноглобулинов в неодинаковой степени участвуют в различных иммунологических реакциях (табл. 18).
Например, в реакциях агглютинации наиболее активны антитела, относящиеся к IgM и IgG, в реакции связывания комплемента участвуют главным образом антитела IgG и IgM, в реакции лизиса с участием лизоцима и комплемента – только IgA.
Часть шестая
ВИРУСЫ И ВЫЗЫВАЕМЫЕ ИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯ
Глава 43
Основные свойства вирусов и их молекулярно-генетическая организация
Приоритет открытия вирусов принадлежит выдающемуся русскому ученому Д. И. Ивановскому. Еще будучи студентом Петербургского университета, в 1887 г. по предложению своих учителей А. Н. Бекетова и А. С. Фаминцына Д. И. Ивановский вместе со студентом В. В. Половцевым приступил к изучению мозаичной болезни табака, наносившей большой вред сельскому хозяйству. Ими было установлено, что описанная в Голландии А. Мейером мозаичная болезнь табака представляет собой не одно, а два совершенно различных заболевания одного и того же растения, одно из которых – рябуха (ее возбудитель – грибок), а другое – собственно мозаичная болезнь табака неизвестного происхождения. Изучение природы этого заболевания Д. И. Ивановский проводил самостоятельно, оно и привело его к открытию первого вируса. Капелькой сока, взятого от больного растения, Д. И. Ивановский заражал здоровое растение и вызывал его заболевание. Это убедило его в том, что инфекционное начало находится в соке. Однако при микроскопии сока он не обнаружил в нем никаких бактерий, а посевы сока на питательные среды не давали никакого роста. Тогда Д. И. Ивановский решил профильтровать такой странный сок через фарфоровые фильтры, через которые бактерии не проходят. Однако профильтрованный сок вызывал мозаичную болезнь у здоровых растений спустя 15 дней после заражения. Еще более любопытным был тот факт, что профильтрованный сок, нагретый до 60 – 70 °C, утрачивал инфекционные свойства. К тому же, при последовательном заражении соком больных растений болезнь проявлялась всегда, т. е. заразное начало не разбавлялось, а будучи введенным в растение, в нем размножалось, значит, являлось живым существом, которое Д. И. Ивановский назвал фильтрующимся вирусом. Результаты своих работ он опубликовал в журнале «Сельское хозяйство и лесоводство» в статье «О двух болезнях табака» и доложил на заседании Российской Академии наук 12 февраля 1892 г. Эта дата и является официальным днем рождения новой науки – вирусологии, а Д. И. Ивановский – ее основоположник.
