Причину различного отношения бактерий к окраске по Граму объясняют тем, что после обработки раствором Люголя образуется не растворимый в спирте комплекс йода с генциановым фиолетовым, который у грамположительных бактерий в связи со слабой проницаемостью их стенки не может диффундировать из клетки, в то время как у грамотрицательных легко удаляется при промывании их этанолом, а затем водой.
Особенности клеточной стенки грамположительных бактерий
Клеточная стенка грамположительных бактерий имеет однородную структуру, пластичный слой тонкий и ковалентно связан с ригидным слоем. Она значительно толще, чем у грамотрицательных – ее толщина 20 – 60 нм. Основную массу стенки составляет пептидогликан. Он представлен не 1 – 2 слоями, как у грамотрицательных бактерий, а 5 – 6, на его долю приходится до 90 % сухой массы клеточной стенки. Клеточная стенка содержит много тейхоевых кислот (до 50 % сухого веса ее). Тейхоевые кислоты (греч. teichos – стенка) – растворимые в воде линейные полимеры, содержащие остатки глицерина или рибитола, связанные между собой фосфодиэфирными связями. Тейхоевые кислоты – главные поверхностные антигены многих грамположительных бактерий. Они в значительном количестве располагаются между цитоплазматической мембраной и слоем пептидогликана и через поры в нем выступают наружу. Функция тейхоевых кислот полностью не выяснена. Клеточная стенка большинства грамположительных бактерий не содержит липидов, однако у микобактерий и коринебактерий в ней имеются токсические гликолипиды.
Особенность пептидогликанов грамположительных бактерий – частое отсутствие в них диаминопимелиновой кислоты. В клеточной стенке грамположительных бактерий отсутствуют липополисахариды; содержание белка в них сильно варьирует. Белки во многом определяют антигенную специфичность таких бактерий. Например, стрептококки серогруппы А по белкам М и Т подразделяют на несколько десятков серотипов.
Особенности клеточной стенки грамотрицательных бактерий
Клеточная стенка грамотрицательных бактерий значительно тоньше, и у большинства из них ее толщина составляет 14 – 18 нм. Четко выделяются два слоя – пластичный и ригидный, они связаны лабильно и отделяются друг от друга при обработке додецилсульфатом натрия. Основная особенность клеточной стенки грамотрицательных бактерий: ригидный слой тонкий, представлен одним или, редко, двумя слоями пептидогликана, на долю которого приходится до 5 – 10 % сухого веса стенки. Для пептидогликана характерно низкое содержание поперечных сшивок между пептидными цепочками, однако в нем почти всегда имеется диаминопимелиновая кислота.
В составе клеточной стенки содержится много липопротеинов, фосфолипидов, липополисахарид, больше белка и, как правило, отсутствуют тейхоевые кислоты. Пластичный слой клеточной стенки у грамотрицательных бактерий представляет собой сложную мозаику, образованную из липопротеинов, липополисахаридов и наружной мембраны.
Липопротеины связывают наружную мембрану с пептидогликаном (белок связан с диаминопимелиновой кислотой бокового тетрапептида, а липид – нековалентно с наружной мембраной).
Липополисахарид (ЛПС) состоит из комплекса липида А и связанного с ним полисахарида, состоящего из ядра, которое одинаково у всех грамотрицательных бактерий, и терминальной цепочки из повторяющихся сахаров (рис. 6). Последние у разных видов бактерий различаются по химической природе. Они обычно представлены линейными трисахаридами или разветвляющимися тетра– или пентасахаридами. Терминальные повторяющиеся единицы полисахарида ЛПС располагаются на поверхности клетки в виде микроворсинок и определяют ее антигенную специфичность. ЛПС синтезируется на цитоплазматической мембране, а затем транспортируется в наружную часть клетки, он прикреплен к наружной мембране с помощью гидрофобных связей. ЛПС выполняет две важнейшие функции у грамотрицательных бактерий: во-первых, он определяет их антигенную специфичность, а во-вторых, является одним из главных факторов их патогенности. ЛПС – это эндотоксин. Его токсичность определяется липидом А. Кроме того, ЛПС в организме запускает синтез около 20 различных биологически активных соединений, которые опосредуют патогенез эндотоксикоза, и обладает пирогенным действием.
Наружная мембрана, подобно любой биологической мембране, состоит из двух слоев липидов, но в ней значительная часть фосфолипидов наружного слоя замещена молекулами липополисахаридов и набором белков, локализованных мозаично (рис. 7). В состав этих белков, заключенных в фосфолипидную матрицу, входят 3 или 4 основных (major), которые составляют около 70 % суммарных белков наружной мембраны; липопротеины и второстепенные белки, числом более 10. Два из основных белков проходят через оба слоя мембраны и прочно связаны с пептидогликаном. Эти белки-порины располагаются в виде триплетов и образуют диффузионные поры, через которые в клетку проникают мелкие гидрофильные молекулы. Второстепенные белки выполняют разнообразные специфические функции: одни из них участвуют в облегченной диффузии, другие – в активном транспорте молекул через наружную мембрану и выступают в качестве специфических рецепторов для фагов и колицинов. Некоторые из этих белков участвуют в конъюгации (являются рецепторами для донорных ворсинок), в контроле репликации ДНК и регуляции клеточного деления. Наружная мембрана осуществляет также функцию барьера, через который в клетку не способны проникать крупные молекулы (один из механизмов неспецифической устойчивости грамотрицательных бактерий к антибиотикам). Если бактерии поместить в гипертонический раствор, наступает резкое обезвоживание клеток, цитоплазма съеживается, и протопласт отходит от клеточной стенки. Это явление называется плазмолизом. В результате плазмолиза клетки гибнут. Этим свойством широко пользуются для консервирования пищевых продуктов с помощью концентрированных растворов поваренной соли или сахара. Однако плазмолиз проявляется не в одинаковой степени у разных видов бактерий. К нему особенно устойчивы Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, которые являются частыми виновниками пищевых отравлений. В случае помещения бактерий в дистиллированную воду или гипотонические растворы солей происходит противоположное явление – плазмоптиз: вода устремляется в клетки, происходит их набухание и разрушение.
Рис. 6. Структура липополисахарида грамотрицательных бактерий:
1 – повторяющиеся единицы; 2 – ядро; 3 – полимер дисахарид-фосфата; 4 – жирные кислоты; 5 – липид
Рис. 7. Схематическое изображение структур наружной мембраны (1), пептидогликана (2) и плазматической мембраны (3) E. coli
При обработке грамположительных бактерий ферментами, разрушающими пептидогликан, возникают протопласты, т. е. структуры, полностью лишенные клеточной стенки. Обработка грамотрицательных бактерий лизоцимом разрушает только слой пептидогликана клеточной стенки, но наружная мембрана (или, по крайней мере, часть ее) сохраняется. Такие структуры получили название сферопластов. Протопласты и сферопласты имеют сферическую форму и в соответствующих осмотических условиях сохраняют жизнеспособность. Особенно чувствительны к изменению осмотического давления протопласты. При определенных условиях они способны к размножению подобно L-формам бактерий. Нарушение синтеза клеточной стенки лежит в основе L-трансформации бактерий.
Впервые эта форма изменчивости бактерий была описана в 1935 г. Е. Клинебергер. Она обнаружила и выделила из культуры Streptobacillus moniliformis необычные варианты, которые росли в виде маленьких характерных колоний с врастающей в агар центральной и фестончатой полупрозрачной периферической зонами. В этих колониях обнаруживались самые разнообразные по морфологии структуры: нитевидные, волокнистые, колбасовидные, шаровидные образования и мелкие гранулы размером 0,1 – 0,15 мкм (фильтрующиеся формы бактерий). Поскольку этот феномен был обнаружен в институте имени Листера, то таким необычным вариантам бактерий дали название L-форм, а такую изменчивость бактерий назвали L-трансформацией. Она может быть обратимой и необратимой. В случае если генетический контроль синтеза клеточной стенки сохраняется, L-формы при благоприятных условиях могут возвращаться в исходную бактериальную форму с восстановлением всех основных биологических свойств, включая патогенность. Если же генетический контроль синтеза клеточной стенки нарушен необратимо, L-трансформация приобретает необратимый характер, а такие L-трансформанты по своим морфологическим, культуральным и иным свойствам становятся неотличимыми от микоплазм. L-трансформации могут подвергаться, по-видимому, все бактерии, имеющие клеточную стенку, а все образующиеся L-формы, независимо от вида бактерий, из которого они возникли, обладают следующими общими для них особенностями:
