Ферменты бактериальной клетки могут модифицировать ДНК внедрившегося фага еще до того, как его атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приведет к лизису клетки, а все потомство такого фага будет содержать также модифицированную ДНК. Оно будет способно заражать другие бактерии с такой же системой репарации.
К 1977 г. А. Максамом, У. Гилбертом и Ф. Сэнджером (Gilbert W., 1981; Sanger F., 1981) были разработаны специальные методы определения нуклеотидных последовательностей ДНК, которые получили название секвенирование (от англ. sequence – последовательность). Эти методы сыграли судьбоносную роль в становлении геномики и генной инженерии. Методы секвенирования основаны на создании набора одноцепочечных фрагментов ДНК, оканчивающихся определенным нуклеотидом, для чего используются специфические рестриктазы. Разработаны разные методические подходы секвенирования и способы выделения набора фрагментов. В настоящее время высокий уровень технического оснащения сделал секвенирование достаточно рутинной лабораторной работой.
Синтез генов путем обратной транскрипции первоначально представлялся наиболее перспективным. Если известна хотя бы часть первичной структуры нужного белка, то можно синтезировать коллинеарную часть соответствующего гена. Такие участки получили название ДНК-зондов. Их применяют для поиска м-РНК, имеющей комплементарный им участок. Выделенную с помощью зонда м-РНК можно использовать для синтеза комплементарной ДНК (к-ДНК) путем обратной транскрипции. После синтеза одной цепи с помощью ДНК-полимеразы можно синтезировать вторую цепь.
Большим недостатком этого метода является отсутствие регуляторных элементов в синтезированных генах, необходимых для экспрессии. К тому же часто к-ДНК является упрощенной копией гена, поскольку содержит только его кодирующую часть, т. е. экзоны (без интронов).
7.2. Создание рекомбинантной ДНК
Для переноса необходимого генетического материала используются особые структуры, способные переносить чужеродную ДНК в клетку-реципиент – векторы. Еще в начале развития генной инженерии векторы получили название «молекулярное такси». В качестве векторов могут использоваться два вида структур, содержащих ДНК: плазмиды и вирусы. ДНК вектора разрезают теми же рестриктазами, которые использовались для экзогенной ДНК.
Рестриктазы, обычно используемые в генной инженерии, разрезают обе цепи ДНК в симметричных точках палиндромов – коротких участков ДНК, в которых запись нуклеотидов слева направо в одной цепи аналогична записи справа налево другой цепи. Так, первая рестриктаза, которая нашла широкое применение, EcoR1, узнает последовательность GAATTC. Участок цепи ДНК она всегда разрывает между точками G и А.
Поэтому фрагменты ДНК, полученные при помощи этой рестриктазы, всегда несут на своих концах одноцепочечные участки ААТТ и ТТАА, комплементарные друг другу. Такие участки получили название «липкие концы», поскольку они позволяют любые фрагменты ДНК, полученные при помощи одной рестриктазы, соединять друг с другом. Это свойство и используется для соединения полученной ДНК и ДНК вектора.
Каждая рестриктаза узнает свою специфичную последовательность. Некоторые рестриктазы дают «липкие концы», другие – «тупые концы», воздействуя на связи, расположенные точно друг против друга. «Тупые концы» можно превратить в «липкие», присоединив искусственно синтезированные последовательности, узнаваемые определенной рестриктазой, – линкеры. Они позволяют клонировать любые фрагменты чужеродной ДНК безотносительно к специфичности сайтов рестрикции. Иногда к «тупым концам» присоединяют (при помощи фермента терминальная трансфераза) комплементарные «хвосты» – поли (А) и поли (Т).
7.3. Введение рекомбинантной ДНК в клетку
К настоящему времени сконструировано множество типов векторов на основе разнообразных плазмид и вирусов.
Плазмиды являются основным материалом векторов. Геном плазмид представляет собой кольцевую ДНК и имеет систему контроля репликации, которая поддерживает их количество в бактериальной клетке на определенном уровне. Многие плазмиды несут гены, обусловливающие устойчивость к антибиотикам.
На первых этапах генной инженерии применяли естественные плазмиды бактерий. Сейчас создают искусственные (рекомбинантные) плазмиды со стандартными свойствами. Они обычно содержат один сайт рестрикции к какой-либо одной рестриктазе, несут два гена устойчивости к разным антибиотикам и имеют ослабленный контроль репликации. Контроль репликации, свойственный природным плазмидам, ограничивает число плазмид в клетке. Обычно бактериальная клетка имеет 20–30 плазмид, но ослабленный контроль репликации позволяет накапливать в клетке более 1000 плазмид.
Разрыв ДНК плазмиды в сайте рестрикции превращает ее в линейную молекулу. Если той же рестриктазой была разрезана и чужеродная ДНК для выделения нужного гена, то этот ген можно «сшить» с плазмидной ДНК по одинаковым «липким концам» (рис. 7.1).
Рис. 7.1. Плазмида-вектор с встроенной экзогенной ДНК
Полученная гибридная (или химерная) плазмида будет представлять собой рекомбинантную ДНК. Гибридная плазмида может существовать в бактериальной клетке долгое время. Она реплицируется так же, как и исходная плазмида. Обычно встроенная чужеродная ДНК не влияет на свойства бактерий.
Единственные известные в природе эукариотические плазмиды обнаружены у дрожжей. В генной инженерии были «сконструированы» особые плазмиды, способные существовать в клетках как бактерии E. coli, так и дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В этом случае один и тот же вектор может быть использован с двумя хозяевами.
Явление переноса генетической информации при помощи вирусов называется трансдукцией и встречается в живой природе.
В генной инженерии наиболее широко применяется фаг ë. ДНК фага представляет собой линейную молекулу, поэтому один разрыв рестриктазой приводит к образованию двух фрагментов. Эти фрагменты сшивают с чужеродной ДНК, в результате чего образуется химерный фаг. Этот фаг должен пройти цикл литической инфекции для накопления достаточного количества встроенной ДНК.
Размер встраиваемой ДНК не должен превышать 10 % генома фага, иначе он не поместится в капсид. Для решения этой проблемыу фага-вектора удаляют часть собственной ДНК, оставляя только необходимые гены.
В последнее время разработаны тонкие методы введения экзогенной ДНК в клетки-реципиенты при помощи микроинъекций.
Экспрессия чужеродного генетического материала в клетке-реципиенте представлялась наиболее трудной задачей на заре становления генной инженерии.
Накопление необходимого количества ДНК, при использовании как вирусных, так и плазмидных векторов происходит в бактериальной клетке-хозяине. Обычно эукариотические гены в бактериальной клетке не экспрессируются. Для преодоления этого барьера разработаны различные подходы.
В последние годы большое значение приобрел новый метод – полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющий размножить любой интересующий исследователя фрагмент ДНК. Для этого используются специфические праймеры (затравки) длиной 18–20 нуклеотидов и термостойкие ДНК-полимеразы. ПЦР позволяет увеличить количество ДНК любого участка в сотни раз.
Для транскрипции эукариотического гена в бактериальной клетке он должен быть помещен под контроль бактериального промотора. Это достигается встраиванием либо кодирующей последовательности эукариотического гена в структуру оперона (причем рядом с промотором), либо бактериального промотора в вектор.
Для трансляции синтезированной чужеродной м-РНК были сконструированы векторы, в которых сайт рестрикции находится рядом с участком связывания рибосомы (за промотором), а вставка начинается со стартового кодона.
При трансформации эукариот посредством ДНК бактерий необходимо учитывать, что репликаторы бактериальной клетки в эукариотической клетке не работают. Для преодоления этого барьера введенная ДНК должна быть интегрирована с хромосомой, что значительно легче осуществить у микроорганизмов. Хорошую модель такого процесса мы можем наблюдать в природе. Было показано, что причиной опухолей некоторых растений является бактериальная Ti-плазмида длиной около 200 000 п. н. Эти плазмиды проникают в клетки растений, часть ДНК Ti-плазмиды (Т-ДНК) встраивается в хромосомы растений и вызывает образование опухолей, нарушая баланс фитогормонов. С помощью Ti-плазмиды были проведены различные эксперименты на растениях (Инге-Вечтомов С. Г., 1989).
