Большой вклад в развитие общей, технической и сельскохозяйственной микробиологии внесли академики В. Н. Шапошников (1884 – 1968), Н. Д. Иерусалимский (1901 – 1967), Б. Л. Исаченко (1871 – 1947), Н. А. Красильников (1896 – 1973), В. Л. Омелянский (1867 – 1928), С. П. Костычев (1877 – 1931), Е. И. Мишустин (1901 – 1983) и их многочисленные ученики. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология во многом обязаны исследованиям таких широко известных отечественных ученых, как Н. Ф. Гамалея (1859 – 1949), П. Ф. Здродовский (1890 – 1976), Л. А. Зильбер (1894 – 1966), В. Д. Тимаков, Е. И. Марциновский (1874 – 1934), В. М. Жданов (1914 – 1987), З. В. Ермольева (1898 – 1979), А. А. Смородинцев (1901 – 1989), М. П. Чумаков (1909 – 1990), П. Н. Кашкин (1902 – 1991), Б. П. Первушин (1895 – 1961) и многих других. Трудами отечественных микробиологов, иммунологов и вирусологов внесен крупный вклад в развитие мировой науки, в теорию и практику здравоохранения.
Преподавание в России микробиологии было начато И. И. Мечниковым и Я. Ю. Бардахом в 1885 г. в Новороссийском университете (Одесса). В 1892 г. Г. Н. Габричевский (1860 – 1907) организовал в Московском университете самостоятельный курс бактериологии, на основе которого затем была создана кафедра.
Глава 2
Микроскопические методы исследования микроорганизмов
Размеры всех объектов, являющихся предметом изучения микробиологии и вирусологии, лежат далеко за пределами разрешающей способности человеческого глаза. Морфология микроорганизма (его форма, размеры, взаиморасположение клеток, поверхностные структуры, внутренняя организация) является чрезвычайно важной его характеристикой и лежит в основе таксономии. Поэтому одним из главных методов исследования в области микробиологии является микроскопия. Основу микроскопических методов исследования составляют световая микроскопия со всеми ее разновидностями (темнопольная, фазово-контрастная, аноптральная, люминесцентная и др.) и электронная микроскопия. Выбор метода определяется целями, стоящими перед исследователем.
В основе световой микроскопии лежат различные свойства света. Современные световые микроскопы представляют собой довольно сложные приборы, совершенствуемые в течение 400 лет с момента создания первого прототипа микроскопа. Современный биологический световой микроскоп состоит из следующих основных элементов: штатива, состоящего из массивного основания (башмака), и тубусодержателя, на котором смонтирована механическая система грубой и тонкой настройки, револьвер с 3 – 4 сменными объективами, предметный столик с конденсором и диафрагмой и под ним светонаправляющее зеркало, концентрирующее естественный или искусственный свет на объект исследования, находящийся на предметном столике. Тубусодержатель микроскопа заканчивается головкой, на которой крепится монокулярный или бинокулярный тубус с окуляром или окулярами. Предметный столик имеет приспособление для крепления предметного стекла с препаратом и механизма для его перемещения.
Иммерсионная световая микроскопия
Важнейшей характеристикой каждого объектива, как и любой оптической системы, является его разрешающая способность. Под разрешающей способностью понимают минимальное расстояние между двумя точками, при котором они еще видны раздельно, т. е. не сливаются в одну. Разрешающая способность объектива ограничивается такими недостатками оптической системы, как сферическая и хроматическая аберрация, дифракция и т. д. Если первые два явления устранимы, то явление дифракции наблюдается в любой оптической системе. Она ограничивает разрешающую способность оптических систем. Разрешающая способность объектива с учетом явлений дифракции описывается следующей формулой:
где А – разрешающая способность; n – показатель преломления среды между препаратом и фронтальной линзой объектива (в случае масляной иммерсии n = 1,51);
α – угол между оптической осью объектива и самым крайним лучом, попадающим в объектив из центра препарата; λ – длина световой волны; 0,61 – коэффициент учета геометрических факторов при вычислении освещенности первого дифракционного максимума от круглого отверстия.
Величина n · sin α постоянна для каждого объектива и называется числовой, или нумерической, апертурой. Она выгравирована на оправе объектива. В монобромнафталиновых иммерсионных объективах нумерическая апертура может варьировать в пределах от 1,25 до 1,60. При наличии воздуха между фронтальной линзой и покровным стеклом нумерическая апертура не превышает 0,95 (сухие объективы). Из приведенной выше формулы видно, что разрешающая способность объектива прямо пропорциональна его числовой апертуре и обратно пропорциональна длине волны света, используемого для микроскопии. При микроскопии в видимом свете с длиной волны 0,55 мкм (550 нм) и иммерсионным объективом с нумерической максимальной апертурой 1,60 разрешающая способность равна:
Таким образом, даже в идеальном световом микроскопе нельзя увидеть объекты размером менее 0,2 мкм.
Величина угла, при котором глаз способен различать раздельно две точки, называется углом резкого зрения. Для получения на сетчатке четкого раздельного изображения двух точек световые лучи должны попасть в глаз под углом зрения, который стягивает дугу от 2 до 4 минут.
Изображение структур, разрешенных объективом, может быть увеличено окуляром лишь настолько, чтобы было различимо под углом, стягивающим дугу величиной от 2 до 4 минут. Это полезное увеличение микроскопа. Полезное увеличение микроскопа не может превышать числовую апертуру более чем в 1000 раз. Поэтому максимальное полезное увеличение для микроскопов, имеющих иммерсионные объективы с апертурой 1,4 – 1,6, составляет 1400 – 1600. Применение в таких микроскопах более сильных окуляров не выявляет никаких дополнительных деталей в разрешаемой объективом структуре препарата.
Фазово-контрастная микроскопия
Обыкновенные окрашенные препараты поглощают часть проходящего через них света, в результате чего амплитуда световых волн снижается, и частицы препарата выглядят темнее фона. При прохождении света через неокрашенный препарат амплитуда световых волн не меняется, происходит лишь изменение фазы световых волн, прошедших через частицы препарата. Однако человеческий глаз улавливать это изменение фазы света не способен, поэтому неокрашенный препарат при правильной установке освещения в микроскопе будет невидим.
Фазово-контрастное устройство позволяет превратить изменение фазы лучей, прошедших через частицы неокрашенного препарата, в изменения амплитуды, воспринимаемые человеческим глазом, и, таким образом, позволяет сделать неокрашенные препараты отчетливо видимыми.
Приспособление для фазово-контрастной микроскопии включает в себя конденсор с набором кольцевых диафрагм, обеспечивающих освещение препарата полным конусом света, и фазово-контрастные объективы, которые отличаются от обычных тем, что в их главном фокусе располагается полупрозрачная фазовая пластинка в виде кольца, вызывающая сдвиг фазы проходящего через нее света. Установку освещения проводят так, чтобы весь свет, прошедший через кольцевидную диафрагму конденсора, в дальнейшем прошел через расположенное в объективе фазовое кольцо.
При рассмотрении препарата весь свет, прошедший через участки препарата, в которых нет каких-либо объектов, пройдет через фазовое кольцо и даст светлое изображение фона. Свет, прошедший через имеющиеся в препарате частицы, например бактериальные клетки, получит некоторое изменение фазы и, кроме того, разделится на два луча – недифрагированный и дифрагированный. Недифрагированные лучи, пройдя в дальнейшем через кольцевидную фазовую пластинку в объективе, получат дополнительный сдвиг фазы. Дифрагированные лучи пройдут мимо фазовой пластинки, и их фаза не изменится. В плоскости полевой диафрагмы окуляра произойдет интерференция (наложение) дифрагированного и недифрагированного лучей, а так как эти лучи идут в разных фазах, произойдет их взаимное частичное гашение и уменьшение амплитуды. Благодаря этому микробные клетки будут выглядеть темными на светлом фоне.
Существенными недостатками фазово-контрастной микроскопии являются слабая контрастность получаемых изображений и наличие светящихся ореолов вокруг объектов. Фазово-контрастная микроскопия не увеличивает разрешающей способности микроскопа, но помогает выявить детали структуры живых бактерий, стадии их развития, изменения в них под действием различных агентов (антибиотики, химические вещества и т. д.).
Аноптральная микроскопия (амплитудно-контрастная, фазово-темнопольная)
