Необычный механизм устойчивости к изониазиду обнаружен у Mycobacterium tuberculosis. Действие изониазида на туберкулезную палочку зависит от наличия у последней плазмиды, в составе которой имеется особый ген. Продукт этого гена превращает неактивный изониазид в активную форму, которая разрушает бактериальную клетку. Утрата этого гена обусловливает устойчивость M. tuberculosis к изониазиду.
В некоторых случаях инактивацию антибиотиков, которая лежит в основе резистентности к ним, бактерии могут осуществлять разными механизмами. Так, например, существует три механизма, ответственных за формирование устойчивости к бета-лактамным антибиотикам: слабая проницаемость наружной мембраны клеточной стенки грамотрицательных бактерий, обеспечивающая природную устойчивость; изменение структуры пенициллинсвязывающих белков в результате мутаций, которое приводит к утрате их сродства к антибиотику; продукция бета-лактамаз, разрушающих антибиотик. Существует три типа устойчивости и к тетрациклинам: 1) устойчивость, определяемая выносом тетрациклина из клетки белком цитоплазматической мембраны; 2) устойчивость, определяемая изменением структуры белка-мишени рибосом; 3) устойчивость, определяемая модификацией тетрациклина в неактивную форму.
Возможно, у бактерий существуют и другие механизмы формирования устойчивости к лекарственным препаратам.
Таким образом, в ответ на мощный натиск, который предпринял человек на бактерии с помощью антибиотиков, они ответили уникальными биологическими реакциями, сила которых не уступает силе атаки. На каждый новый антибиотик бактерии давали адекватный ответ: появлялись резистентные к нему штаммы, которые и сводили на нет биологическую активность этого препарата. Так было и так будет всегда. С этим нельзя не считаться и этого нельзя не учитывать. Поэтому следует постоянно искать пути преодоления этого препятствия, ибо пока существуют инфекционные болезни, их надо уметь эффективно лечить. Пути преодоления устойчивости к лекарственным препаратам будут рассмотрены ниже.
Возникает вопрос: каковы возможности и пути образования лекарственной устойчивости у бактерий? Поскольку они формируются только на генетическом уровне, то возникает и другой вопрос: откуда появляются новые гены лекарственной устойчивости? Устойчивость, возникающая как следствие мутации, объяснима и понятна, но не она играет основную роль. Основная роль принадлежит генам, которые содержатся в R-плазмидах, а они ведь не могут возникать сразу, de novo. Следовательно, в природе должен существовать своеобразный фонд генов лекарственной устойчивости, откуда бактерии могут постоянно «захватывать» те гены, которые необходимы для них в данной ситуации. Наиболее вероятно, что такой фонд образуется за счет генов, имеющихся у продуцентов антибиотиков. Каждый из них защищен от синтезируемого им антибиотика. Эта самозащита контролируется соответствующим геном. Следовательно, сколько бы ни было в природе антибиотиков, против каждого из них должен быть и ген самозащиты, ген устойчивости к этому антибиотику. В природе, особенно в почве, а также в кишечнике человека и животных, микроорганизмы сосуществуют в столь тесных взаимоотношениях, что это обеспечивает им постоянную возможность обмена генетическим материалом с помощью различных механизмов, в том числе с помощью конъюгации. Поскольку многие гены лекарственной устойчивости несут в себе транспонируемые элементы, это обеспечивает им высокую мобильность. Они могут перемещаться внутри хромосомы, переходить из хромосом в плазмиды, формировать новые варианты плазмид и подвергаться другим превращениям. Таким образом, обмен генами лекарственной устойчивости между микроорганизмами в естественных условиях, очевидно, вполне возможен. Решающую роль в их распространении среди возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных начинает играть уже сам антибиотик. Опыт показывает, что раньше всего гены лекарственной устойчивости к каждому новому антибиотику появляются у клинических штаммов, а затем начинается их дальнейшая циркуляция в природе. Обладая определенной мобильностью, эти гены сами подвергаются модификации, мутациям, а в результате образуют группы, семейства генов, определяющих устойчивость к различным вариантам модифицированного антибиотика. Хотя многое еще придется изучить в этом плане, но общая тенденция и масштабы развития у бактерий лекарственной устойчивости уже вполне объяснимы.
Каковы же возможные перспективы поиска новых антибиотиков, иначе говоря, какими новыми свойствами должны обладать новые антибиотики, чтобы преодолеть известные у бактерий механизмы защиты от них?
Желателен поиск таких антибиотиков, которые бы:
1) имели иную молекулярную структуру и иные мишени в бактериальной клетке, отсутствующие (или, по крайней мере, хорошо защищенные от данного антибиотика) в эукариотной клетке;
2) обладали новым механизмом транспорта в бактериальную клетку;
3) были бы нечувствительны к защитным ферментам и не индуцировали бы их синтез;
4) отвечали бы всем остальным требованиям, предъявляемым к антибиотикам.
Способы определения чувствительности (резистентности) бактерий к химиопрепаратам
Чувствительными к антибиотикам и химиопрепаратам в клинической практике считаются те микроорганизмы, на которые препарат в концентрации, достигаемой в очаге инфекции, оказывает бактериостатическое или бактерицидное действие. Поэтому критерии чувствительности возбудителя зависят от концентрации лечебного препарата в очаге инфекции, величины максимальной терапевтической дозы химиопрепарата, его фармакокинетики и токсичности.
Существуют различные способы определения чувствительности бактерий к антибиотикам, но чаще всего используются два из них: метод диффузии в агар с применением стандартных дисков, пропитанных антибиотиком, и метод серийных разведений антибиотика.
Первый из них заключается в использовании заранее приготовленных из фильтровального картона дисков диаметром 6 ± 0,5 мм. В России выпускается более 20 стандартных дисков. Содержание антибиотика в диске указано на этикетке и соответствует рекомендациям ВОЗ. Содержание антибиотика в диске варьирует в зависимости от его терапевтической дозы и выражается в мкг/мл или в единицах действия (ЕД). Диски одного наименования содержат одну дозу антибиотика; она составляет: 5 мкг/мл (рифампицин), 6 мкг/мл или 10 мкг/мл (бензилпенициллин), 10 мкг/мл (ампициллин, метициллин, оксациллин, гентамицин, сизомицин, доксициклин, фузидин), 15 мкг/мл (эритромицин, линкомицин, олеандомицин), 25 мкг/мл (карбенициллин), 30 мкг/мл (цефалексин, цефалотин, неомицин, стрептомицин, канамицин, мономицин, тетрациклин, левомицетин, ристомицин), 300 ЕД (полимиксин). Диски с различными антибиотиками отличаются друг от друга по цвету (белые, зеленые, желтые и т. д.) или коду, который представляет собой первую букву названия антибиотика, вытисненную на диске.
Поскольку определяемая in vitro степень чувствительности микробов к антибиотикам зависит от условий опыта, для получения достоверных и воспроизводимых результатов необходимо точное соблюдение правил, регламентированных соответствующими методическими указаниями, а также использование стандартных питательных сред и дисков. Оценка результатов определения чувствительности основана на установлении зависимости между размером зон подавления роста исследуемых культур вокруг дисков с антибиотиками и значениями минимальных подавляющих концентраций (МПК) соответствующих антибиотиков в отношении тех или иных культур. Установление такой зависимости в соответствии с методическими указаниями позволяет придать оценке результатов полуколичественный характер и отнести исследуемые культуры бактерий к одной из трех категорий: устойчивые, умеренно устойчивые, чувствительные.
Для испытания чувствительности диски с антибиотиками наносят на поверхность агара, на который перед этим засевают исследуемую культуру. На одну чашку помещают не более 6 дисков. Чашки инкубируют в термостате в течение 18 – 20 часов при температуре 35 – 37 °C. После этого с помощью линейки измеряют диаметр зон задержки роста вокруг дисков (включая диаметр самих дисков) с точностью до 1 мм (рис. 59). Оценку результатов проводят с помощью специальной таблицы, имеющейся в «Методических указаниях по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков» (1983). Эта таблица содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов. Перечень основных микроорганизмов, подлежащих эпидемиологическому наблюдению, и их кодовые наименования приведены в табл. 7.
