Ферменты – это белки, а клетки синтезируют сотни различных белков. Моно понял, что этот вопрос, в сущности, является вопросом регуляции: как клетка «решает» производить в конкретных условиях какой-то определенный фермент, но не другие?
Моно верил, что его исследования регуляции бактериальных ферментов позволят разобраться отнюдь не только в гастрономических пристрастиях микробов-сладкоежек. Он понимал, что отличия между разными типами клеток в организмах более сложноорганизованных существ также определяются регуляцией. Например, эритроциты синтезируют белковую часть гемоглобина, транспортирующего кислород, а лейкоциты синтезируют белки антител, борющихся с инфекциями. Моно полагал, что, если понять, почему и как бактерия синтезирует определенный фермент, это поможет пролить свет на образование различных типов клеток.
Чтобы хоть немного проникнуть в эту тайну, он решил сосредоточиться на одном сахаре – это был молочный сахар лактоза – и исследовать одного «ключевого игрока» – бактериальный фермент, разлагающий лактозу на галактозу и глюкозу. Этот фермент называется β-галактосидазой. Бактерии предпочитают извлекать энергию из простых сахаров. Чтобы использовать лактозу – соединение, состоящее из двух сахаров, глюкозы и галактозы, – эту молекулу требуется расщеплять надвое.
В конце 1940-х и начале 1950-х молекулярная биология только зарождалась, было сложно понять, как ставить большинство экспериментов. Моно и его группа превосходно разрабатывали технологии, позволявшие интерпретировать различные возможности. Основное наблюдение заключалось в следующем: фермент начинал образовываться благодаря присутствию сахара. Возможное объяснение было таким: сахар каким-то образом активировал фермент, непосредственно связываясь с уже имеющейся неактивной формой фермента в бактериальной клетке и преобразуя этот фермент в активную форму. Разработав ряд умных и технически нетривиальных экспериментов, Моно с коллегами отбраковали эту идею.
Опыты Моно показали, что лактоза жестко регулировала производство фермента. Когда E. coli росла в отсутствии лактозы, во всей клетке можно было найти всего несколько молекул фермента β-галактосидазы. Стоило добавить лактозу, и всего за несколько минут в одной клетке появлялось уже несколько тысяч таких молекул. При удалении сахара синтез фермента прекращался (рис. 3.5). Такое включение и выключение производства фермента непонятным образом зависели от присутствия или отсутствия сахара. Принято говорить, что сахар является индуктором синтеза фермента.
Со стороны бактерии это было весьма логично: она синтезировала фермент только при наличии лактозы (источника пищи) и не тратила энергию на производство фермента впустую, когда лактозы вокруг не было. Но как работала эта логика?
Моно несколько лет не удавалось уловить законы регуляции синтеза ферментов. На то было две причины. Во-первых, у него существовало предубеждение насчет того, как может работать логика регуляции. Простое наблюдение показывало: бактерия синтезирует фермент в присутствии сахара, индуктора. Моно и его коллеги продолжали воспринимать индуктор как нечто положительно контролирующее синтез ферментов (здесь и далее схематически изображается стрелкой →).
Чтобы совершить прорыв, им оставалось открыть еще одного «ключевого игрока» и прийти к обратной логике.
Я объясню, как они в итоге во всем разобрались, но верная логика настолько важна для понимания регуляции и всей книги, что я не хотел бы, чтобы вы увязли в этих экспериментальных деталях и упустили общую картину. Поэтому сразу расскажу вам, о чем не догадывался Моно и как лактоза регулирует синтез ферментов. Затем вернусь к этому месту и опишу, как Моно с коллегами во всем разобрались.
Тем «игроком», которого требовалось открыть Моно, был другой белок, действующий в качестве посредника между ферментом и лактозой. Этот белок называется репрессором, так как его задача заключается именно в угнетении синтеза фермента β-галактосидазы. Такая обратная логика осознается, как только понимаешь, что лактоза не оказывает прямого положительного контроля на синтез фермента. На самом деле лактоза ингибирует репрессор, который в таком случае прекращает угнетать синтез фермента.
Рис. 3.5
Индуцирование синтеза фермента. Когда индуктор, например лактоза, добавляется в популяцию E. coli, синтезируется фермент β-галактосидаза. При удалении индуктора синтез фермента останавливается
Из работы Моно и Жакоба (1961), перерисовано Лиэнн Олдз
Логика такова: минус на минус дает плюс.
Закон двойного отрицания при ферментной регуляции имеет огромный биологический смысл: в отсутствии лактозы фермент, расщепляющий сахар, не нужен, и репрессор не дает синтезировать фермент (ниже и далее в книге отрицательная регуляция обозначается символом ┴); если лактоза присутствует, то она ингибирует репрессор; таким образом, ген фермента включается, фермент расщепляет сахар и обеспечивает клетку энергией.
Такая красивая логика и экономия у простейшей бактерии.
Чуть ниже я подробно расскажу, как работает репрессия, но, на мой взгляд, важность ферментной регуляции здесь и далее в контексте книги заключается не в тонкостях, а в логике как таковой. Прорыв удалось совершить, как только ученые начали мыслить непредвзято. Наблюдая какой-либо феномен, мы склонны выбирать наиболее прямолинейное объяснение, где цепочка причинно-следственных связей состоит из минимального количества звеньев. Если мы видим, как машина едет по улице, то считаем, что водитель жмет газ, а не отпускает тормоз.
Когда наличие A (например, сахара) приводит к появлению B (фермента), мы логически выводим положительную связь: A вызывает B. Нужно подключить воображение, чтобы представить себе иное объяснение: A ингибирует нечто третье (репрессор), который в свою очередь ингибирует B.
Но оказывается, что жизнь – от молекулярного уровня вплоть до экологического – обычно управляется более длинными цепочками причинно-следственных связей, чем кажется на первый взгляд, с большим количеством звеньев. Нужно знать каждое из этих звеньев и природу взаимодействий между ними, чтобы по-настоящему понимать законы регуляции и уметь вмешиваться в их работу.
Чтобы открыть репрессор и понять логику ферментной регуляции, Моно требовалось выйти из плоскости.
Новый подход заключался в использовании генетики. Допустим, вас интересует, как приобретается какой-либо видимый признак, например розовый оттенок цветка. Можно найти ответ методом биохимии: растереть цветок и попытаться выделить все его ферменты, благодаря которым розовый оттенок возникает на материале простых химических веществ. Этот метод сложный и длительный.
Либо можно использовать генетику. Берем семена нескольких растений с розовыми цветами, выращиваем тысячи цветов и ищем среди них те немногие, лепестки которых оказались не розовыми, а, например, белыми. У каждого такого цветка имеется генетический дефект, мутация в гене, отвечающем за розовый цвет лепестков. Затем займемся изучением этих генов.
Значительное преимущество генетического подхода заключается в том, что он объективен, и нам достаточно просто взглянуть на цветы, чтобы найти растения с мутациями в интересующих нас генах. Мы не делаем никаких предположений о количестве «игроков» и о том, что они делают. Генетический метод позволяет обнаружить «игроков», к примеру, не являющихся ферментами. Катализатором многих важнейших прорывов в биологии и медицине за последние полвека оказался генетический метод. В следующих двух главах я приведу два важных примера такого рода из области медицины.
Моно с коллегами искали у бактерий такие мутации, которые нарушали синтез β-галактосидазы. Они выделили два типа мутантов. У первых синтезировался дефективный фермент β-галактосидаза, что было связано с мутациями в самом гене, кодирующем этот фермент. Такие мутации были ожидаемы. Но особенно интересны были мутации второго типа: мутантные бактерии синтезировали фермент и в отсутствие лактозы. Они производили фермент все время (конститутивно), независимо от наличия лактозы. У этих мутантов была нарушена нормальная регуляция синтеза фермента, механизм «включения» и «выключения». Конститутивные мутации возникали не в гене фермента, а в другом гене, но каким-то образом нарушали ферментную регуляцию.
Понимание того, как действует этот «игрок», стало ключом к пониманию ферментной регуляции. Но сперва Моно был озадачен. Он попытался интерпретировать конститутивных мутантов сквозь призму индуктора, действующего в качестве положительного регулятора синтеза фермента. Ученый рассуждал, что если мутантная бактерия не нуждалась в индукторе, чтобы синтезировать фермент, то мутанты должны сами синтезировать «внутренний» индуктор β-галактосидазы. Ошибку в логике Моно удалось обнаружить только после того, как к работе подключился новый человек.
