Рис. 20. Прохождение ДНК через нанопору. В мембране, разделяющей ячейку на две половины, проделано отверстие диаметром около 4 нм. Это и есть нанопора. В обеих половинах ячейки находится солевой раствор (диссоциированные ионы соли обозначены точками), но молекулы ДНК первоначально находятся только в той половине, к которой приложено отрицательное напряжение. Ток в ячейке измеряется амперметром (А)
Основу нанопор-секвенатора составляют миниатюрные камеры, к которым подведено электрическое напряжение (рис. 20). Камера разделена на две части при помощи очень тонкой мембраны и заполнена буфером, т. е. подсоленной водой с определенным значением pH. В одну из двух половин, ту, к которой подключен «—» постоянного тока, вводится одноцепочечная ДНК. В мембране сделана малюсенькая дырка диаметром в несколько нанометров, одна на всю мембрану, которая и есть та самая нанопора. Если никаких молекул ДНК в камере нет, через камеру протекает ток определенной силы, вызванный прохождением ионов соли сквозь мембрану, через нанопору. Если ввести молекулу ДНК, то, подобно ситуации с электрофорезом, которую мы уже обсуждали в этой главе, ДНК начнет мигрировать от отрицательно к положительно заряженной половине камеры. После многочисленных неудачных попыток ДНК начнет пролезать через нанопору. Что будет с током? Он упадет, ведь пока молекула ДНК пролезает сквозь нанопору, она блокирует существенную часть поперечного сечения нанопоры, и ионам остается меньше места для прохождения сквозь мембрану, электрическое сопротивление мембраны увеличивается, и, соответственно, ток падает. Чтобы сделать из нанопоры секвенатор, надо было добиться, чтобы ток, протекающий через нанопору, зависел от того, какая последовательность нуклеотидов проходит в данный момент сквозь нанопору.
Добиться этого оказалось очень трудной задачей, над которой начиная с середины 1990-х годов, когда впервые возникла идея нанопорового секвенирования, бились многие. Наиболее упорным оказался оксфордский профессор Хаган Бейли. У Бейли была мечта: он представлял себе визит пациента к доктору в XXI веке следующим образом. Прежде чем начать осмотр пациента, доктор просит его плюнуть на флешку, которая является нанопоровым секвенатором, вставляет флешку в порт своего компьютера и только после этого начинает медосмотр. Пока доктор измеряет пациенту давление, кардиограмму, спрашивает о жалобах, в его компьютер загружается полная последовательность нуклеотидов генома пациента. Компьютер сам, при помощи облачных технологий и самых современных баз данных, проводит полный анализ генома пациента на предмет его предрасположенности к различным болезням и т. д. К концу осмотра доктор уже имеет в своем распоряжении все эти данные в виде готовых рекомендаций того, какие дальнейшие тесты пациенту необходимо пройти.
Принципиальным моментом на пути создания нанопорового секвенатора была замена простой дырки в мембране на специальный белок с нанопорой внутри, альфа-гемолизин. Этот белок вырабатывается бактерией в качестве токсина, убивающего живую клетку. Белок представляет собой цилиндр с дыркой вдоль оси, так что, когда он внедряется в клеточную стенку, в стенке появляется дырка, и клетка погибает. Нанопора в гемолизине как раз нужного диаметра, так что однонитевая ДНК в нее пролезает, но с трудом, и разные нуклеотиды блокируют пору в разной степени. Бейли еще несколько изменил аминокислотную последовательность белка при помощи генной инженерии и добился существенного улучшения способности белковой нанопоры различать нуклеотиды, проходящие сквозь нее.
Вторым важнейшим моментом была замена неконтролируемого, случайного прохождения молекул ДНК через пору на контролируемое протягивание молекулы. С этой целью используется ДНК-полимераза. Все-таки без этого фермента обойтись не удалось. Но в отличие от методов «секвенирования посредством синтеза» в случае нанопорового секвенирования ДНК-полимераза используется лишь как молекулярный мотор, который, синтезируя на секвенируемой однонитевой ДНК, как на матрице, комплементарную цепь, протягивает однонитевую молекулу ДНК сквозь нанопору, причем скорость протягивания можно контролировать, так как она зависит от концентрации в растворе предшественников нуклеотидов, нуклеозидтрифосфатов. Само считывание последовательности происходит посредством анализа силы ионного тока, протекающего через белковую нанопору.
Когда создание флешки-секвенатора стало казаться реальным, Хаган Бейли основал компанию Oxford Nanopore Technologies Ltd., которая в 2014 году начала выпуск нанопоровых секвенаторов. И все-таки осуществить свою мечту Хагану Бейли не удалось. Несмотря на все усовершенствования, нанопоровый секвенатор делает слишком много случайных ошибок, чтобы им можно было секвенировать геном человека. Но есть задачи, для которых он оказался очень даже пригоден. Если секвенируемый геном небольшой, скажем вирусный, то случайные ошибки не так страшны, их можно исправить многократным прочтением той же ДНК. Зато флешку-секвенатор очень удобно использовать в полевых условиях, вдали от цивилизации. Это преимущество нанопорового секвенатора ярко проявилось во время эпидемии вируса Эболы, вспыхнувшей в Африке в 2013 году и свирепствовавшей два года. Геном вируса Эболы содержит всего 19 тысяч нуклеотидов, так что он очень удобен для нанопорового секвенирования. В 2015 году большая международная команда прибыла в Африку, вооружившись флешками-секвенаторами, и провела огромную работу по выявлению всевозможных мутантных вариантов генома вируса, возникших в ходе эпидемии.
И все же последовательности крупных геномов, включая человеческие геномы, которыми с невероятной скоростью пополняются базы данных, получают с помощью методов, основанных на «секвенировании посредством синтеза», главным образом на секвенаторах «Иллюмины». Только используя в полной мере ДНК-полимеразу, необыкновенно точный инструмент, созданный Природой за миллиарды лет биологической эволюции, удается прочесть последовательности ДНК любых геномов.
После прошедшего за первые 15 лет XXI века радикального удешевления секвенирования геномов доктора получают в свое распоряжение не только полный геном пациента, но, в случае злокачественной опухоли, полные геномы различных клонов раковых клеток, из которых опухоль состоит. Это открывает путь для возникновения и развития персонифицированной медицины, в том числе для совершенно новых подходов к терапии раковых заболеваний, о чем пойдет речь в главе 11.
Теория эволюции и генетика
Между генетикой и теорией эволюции всегда были довольно сложные отношения. Эти науки опираются на весьма надежные, но принципиально различные методы исследования. Эволюционная теория выросла из анализа всего многообразия живущих на Земле существ. Это наблюдательная наука, подобная астрономии. В отличие от нее, генетика носит сугубо экспериментальный характер и весьма схожа с физикой. (Не случайно основоположник генетики Грегор Мендель получил солидное физическое образование – он учился у К. Доплера.) Нет нужды доказывать, что наблюдательная наука, вообще говоря, очень сильно уступает в скорости и возможностях развития науке экспериментальной. Достаточно сравнить прогресс в эволюционной теории и в генетике, достигнутый за последние 100 лет. Конечно, в действительности между наблюдательной и экспериментальной науками нет и не должно быть соревнования. Их уместнее уподоблять супружеской чете, а не двум спортсменам на дистанции. Но, как и между супругами, между ними, конечно, возможны разногласия, а порой даже бурные споры.
По мере того как множились успехи генетики (особенно с переходом ее на молекулярный уровень), все более разрастался конфликт между нею и теорией эволюции, конфликт, который возник еще в начале ХХ века. Суть его состоит в следующем.
Теория эволюции зиждется на двух китах: изменчивости и отборе. Генетика как будто вскрыла механизм изменчивости – в его основе лежат точечные мутации в ДНК. Но та ли это изменчивость, которая способна объяснить эволюцию? Прозорливые умы уже довольно давно поняли, что на такой изменчивости далеко не уедешь. Все новое, что мы узнали в ходе развития молекулярной генетики, подтвердило эти сомнения.
В самом деле, точечные мутации приводят к заменам отдельных аминокислот в белках, в частности, ферментах. Слово точечная означает, что в результате мутации может быть заменен только один аминокислотный остаток в одном из белков целого организма. Мутации чрезвычайно редки, и одновременное изменение даже двух аминокислотных остатков в одном белке совершенно невероятно. Но к чему может привести одиночная замена? Она либо окажется нейтральной, т. е. не повлияет на функцию фермента, либо ухудшит его работу.
