С помощью РТ стало легко выделять и нарабатывать отдельные гены. Для этого больше не надо было искать определенный участок ДНК, «вырезать» его с помощью специальных ферментов и т. д. Все стало проще и «наоборот». Необходимо было просто стимулировать ген к работе, в результате чего он нарабатывал большие количества и-РНКовых копий, которые относительно легко выделяются из клетки. А потом с помощью РТ можно было сделать копию гена в виде ДНК. Чтобы не путать эту сделанную человеком ДНКовую копию с обычным геном клеточной ДНК, «копийный» ген стали обозначать к ДНК.
Теперь скажем два слова относительно «плазмиды». Плазмиды представляют собой крохотные ДНКовые колечки, которые могут «размыкаться» ферментами, встраивать новый ген и переносить его; от клетки к клетке. Впервые с плазмидами ученые столкнулись, когда у микроорганизмов была выявлена устойчивость (резистентность) к антибиотикам. Оказалось, что бактериальные плазмиды несут гены, кодирующие синтез белка, разрушающего молекулу антибиотика. Плазмиды свободно плавают в цитоплазме кишечной палочки, перенося между клетками этого микроорганизма, живущего у нас в толстом кишечнике, «оперативную» генетическую информацию. Ген при необходимости можно также «включить» в геном вируса, который, заражая клетку, размножится в ней и даст много копий необходимого нам гена. Собрав эти копии, мы можем «прочитать» ген, то есть расшифровать последовательность нуклеотидов.
Этот процесс получения копий назвали «клонированием». Слово «клон» в родстве со старым шотландским «клан». Так жители суровой Шотландии называли двенадцать родов — Макинтоши, Макговерны, Макклинтоки и т. д., которые вели борьбу не на жизнь, а на смерть за свою независимость от англичан.
Сегодня процесс чтения генов пока невозможно представить себе-без их клонирования. Обычно это делается следующим образом: ген «нарезается» специальными ферментами на кусочки по 300–400 нуклеотидов, после чего они встраиваются в геном фагов. Таким образом, создается «фаговая библиотека», позволяющая наработать достаточное количество генетического материала. Обычно размножение фагов осуществляется в кишечной палочке — «рабочей лошадке» современной биотехнологии. Последнее время это стало возможно делать и с помощью клеток млекопитающих в культуре, но это гораздо дороже, потому что кишечная палочка весьма неприхотливый организм. Ее потребности не сравнить с «запросами» высокоорганизованных клеток млекопитающих. Но кишечная палочка имеет свой недостаток — с ней бывает трудно получить достаточно полноценный по своим функциям человеческий белок.
И последнее, чтобы можно было дальше продолжать наш рассказ о моратории Берга. Мы уже неоднократно говорили: «разрезать» ДНК, «встроить» ген и т. д. А что все это значит?
В 1959 г. Нобелевскую премию получили С. Очоа и А. Корнберг из Стэнфордского университета. Им удалось впервые выделить особые белки, которые могут «сшивать» или «склеивать» нуклеотиды в полимерные цепочки, синтезируя тем самым макромолекулы ДНК.
Один из таких ферментов был выделен из кишечной палочки и назван ДНК-полимераза. ДНК-полимераза осуществляет синтез ДНК на матрице ДНК. Обратная транскриптаза тоже относится к классу ДНК-полимераз, только синтез при этом осуществляется на матрице РНК. Таким образом ученые получили в свое распоряжение ферменты, сшивающие и полимеризующие ДНК.
Рис. 3. Схема выделения и клонирования гена в клетках кишечной палочки
а) «Вырезание» гена из двуцепочной ДНК
б) «Разрезание» плазмиды и включение в нее чужеродного гена
в) Введение плазмиды с чужим геном в клетку
г) Клонирование гена в делящихся клетках микроорганизма
Однако что делать, если необходимо двуцепочечную спираль ДНК в клетках «разрезать,»? Или, например, в случае мутации, приводящей к появлению неправильной «буквы» в генетическом тексте, эту букву вырезать и заменить на нормальную? В этом помогают ферменты-«рестриктазы», разрезающие цепь ДНК в строго определенном месте (название рестриктаза происходит от того же древнего корня, что и наш глагол «стричь»). Рестриктазы открыл швейцарец В. Арбер в 1970 г. Его дочь Анна потом рассказывала всем: «Мой папа открыл в клетках ножницы, которыми можно стричь ДНК».
В. Арбер работал в Цюрихе с фагами и нашел у них фермент, с помощью которого эти вирусы разрезают хозяйскую ДНК и вставляют в нее свой геном. Американец Г. Смит из университета им. Дж Хопкинса в Балтиморе получил этот фермент в пробирке, а Д. Натанс стал его систематически применять, все трое получили за новый прорыв Нобелевскую премию в 1978 г.
С помощью рестриктаз и сшивающих ДНК ферментов операции на генах стали обычным делом. Не удивительно поэтому, что в 1973 г. у П. Берга из Станфорда созрела идей эксперимента по переносу ракового гена в кишечную, палочку. Эта идея взволновала Поллака, который и позвонил Бергу, чтобы выразить свои сомнения в необходимости такого опасного эксперимента и его правомочности.
Дело в том, что ген ракового вируса СВ-40 предполагалось перенести с плазмидой в клетки кишечной палочки, которая обитает в кишечнике всех людей. Не заложим ли мы бомбу с часовым механизмом под все человечество, спрашивал Поллак. Где гарантия, что такая «переделанная» бактерия не вырвется из лабораторий и не заразит все человечество, породив вселенскую опасность неудержимой эпидемии рака?
Опасения были весьма оправданны. Тогда никто еще не знал, что такое гены раковых вирусов и какое отношение к генезу раковых опухолей у человека Они имеют. Перенос гена в широко распространенную кишечную палочку действительно мог создать непредсказуемую опасность. Поллак вспоминал потом:
«Я поставил Берга в затруднительное положение, поскольку он честный человек и сразу не нашелся, что ответить. Под воздействием нашего разговора он отказался от задуманного эксперимента. Более, того, вскоре он призвал и других ученых добровольно отказаться или воздержаться от проведения подобных экспериментов с „рекомбинантными“ ДНК до выяснения всех обстоятельств, связанных с обеспечением безопасности проводимых опытов…» (Рекомбинантными ДНК в то время называли ДНК, составленные из генов разных организмов, как бы скомбинированных, где часть ДНК взята, например, от вируса, а другая — от кишечной палочки.)
В июле 1974 г, группа Берга опубликовала в американском научном журнале «Сайенс» открытое письмо, призывающее биологов не проводить рискованных экспериментов, что может привести, помимо всего прочего, к появлению бактерий с повышенной устойчивостью к антибиотикам.
Письмо подписал и Дж. Уотсон, который тоже решил выступить против работ по «трансплантации генов». Но многие ученые были против подобного самоограничения. Одним из таких исследователей был учитель Уотсона С. Луриа, который писал:
«Как следует поступить? Самым нерациональным было бы выступать за мораторий в науке, чтобы помешать развитию пагубного метода. Но наука — подобно искусству — стала неотъемлемой частью свободы поиска. Подход ученых, произвольно приостанавливающих научные изыскания до тех пор; пока не решится вопрос об их социальных последствиях, может иметь отрицательные последствия для общества. Положительным можно было бы считать принятие учеными такой ответственности, которая убедительно доказала бы обществу, каковы могут быть последствия новейших научных открытий».
Рис. 4. Клетка кишечной палочки под электронным микроскопом (темная область — клеточная ДНК)
С целью привлечения всеобщего внимания к этой проблеме П. Берг организовал в Асиломаре на берегу Тихого океана неподалеку от Станфорда конференцию. На ней почти единогласно были приняты предложения оргкомитета, в состав которого входил Берг, призывающие проводить некоторые работы с рекомбинантными ДНК в специально оборудованных лабораториях, чтобы не распространять в окружающую среду биологическую опасность.
В дискуссию вступали и другие ученые, которые, казалось бы, были далеки от молекулярной генетики. Нобелевский лауреат Дж. Уолд, получивший свою награду за исследование механизмов зрения на молекулярном уровне, заявил, что новые опыты с бактериями могут умножить число генетических заболеваний.
Ему ответил М. Мезельсон, декан факультета биохимии Гарвардского университета, который в свое время первым экспериментально подтвердил одно из главных положений модели Уотсона и Крика — то, что ДНК двухцепочечна. В отличие от Уолда, Мезельсон всю свою сознательную научную жизнь занимался именно ДНК, поэтому для него эти рекомбинации, плазмиды, гены и полимеразы были хлебом насущным. Мезельсон заявил, что жизненно важное направление научных исследований, сулящее человечеству большие выгоды и избавление от многих бед, находится под угрозой срыва из-за преувеличенной боязни довольно слабо разбирающихся в этом людей.
