мусора.
2. Разломите шляпку гриба (или основание ножки) для получения открытой ткани. Сделайте это настолько чисто, насколько возможно.
3. Зажгите спиртовку и простерилизуйте на пламени лезвие скальпеля. Вырежьте из гриба небольшой кусочек чистой ткани, которая не контактировала с внешней поверхностью. Эту операцию, очевидно, проще провести с более толстым, мясистым грибом, нежели с тонким образцом.
4. Когда кусочек гриба окажется на скальпеле, переместите его на середину одной из агаровых чашек. В связи с тем, что вероятность неудачи остается достаточно высокой, по возможности, сделайте еще несколько переносов на отдельные чашки.
5. В заключение, поместите стопку чашек в чистый пластиковый пакет и поставьте их в подходящее место для инкубации при комнатной температуре.
6. Растущий мицелий, в случае успеха, должен стать заметным через несколько дней, распространяясь по сторонам от кусочка грибной ткани.
Плесень или бактерии тоже могут начать свой рост. В этом случае вам может потребоваться вырезать небольшой кусочек чистого мицелия и перенести его на свежую чашку. Если вы решите произвести дополнительное клонирование мицелия из зараженной плесенью чашки, сделайте это до того, как плесень приобретет темную окраску и созреет до образования спор. В противном случае, вы просто будете переносить плесень вместе с мицелием.
Если вы попытаетесь клонировать мицелий из дикорастущего гриба, запомните, что имеющийся в вашей питательной среде перекись водорода, сама по себе, не сможет очистить мицелий от находящихся в нем источников заражения. Если исходный материал загрязнен, и вы не можете получить чистую ткань путем разламывания ножки или шляпки гриба, который вы собираетесь клонировать, перекись в агаре уже ничем не поможет. Перекись не является стерилизующим агентом. Вместе с тем, если имеющийся материал изначально чист, перекись в агаре позволит, как минимум, снизить число случаев скрытого заражения в полученных агаровых чашках.
Хранение штаммов
После того, как вы приобрели грибную культуру, вам придется найти способ долговременного хранения ее образцов, чтобы с них можно было начать работу заново, если что-то случится с активной культурой, которой вы пользуетесь в настоящее время. Простой метод хранения, которым пользуюсь я, предполагает соскабливание некоторого количества мицелия с агаровой чашки и перенос его в снабженную навинчивающимся колпачком пробирку со стерильной дистиллированной водой (спасибо Joe Kish за то, что он подсказал мне этот метод). Оказавшись в дистиллированной воде, мицелий переходит в состояние спячки (состояние покоя) и некоторые штаммы могут находиться в нем неопределенно долгое время (грибы типа вешенки, по моему опыту, могут храниться в таком виде около года). В этом случае даже не требуется охлаждение.
Несмотря на то, что традиционным способом хранения культур считаются пробирки с косым агаром, если вы не имеете доступа к жидкому азоту, пробирки не позволяют сохранять штаммы слишком долго — в лучшем случае, полгода.
Далее, когда вы готовите штаммы к длительному хранению, я не рекомендую при этом использовать перекись водорода. Дело в том, что на самом деле я не знаю, какое влияние может оказать перекись на культуры, находящиеся на хранении в течение длительного времени. Ускоряет ли он старение? Вызывает ли он постепенное ослабление штаммов и их генетические изменения? Я просто не исключаю, что могут быть проблемы с некоторыми видами, которые вы хотите сохранить. Кроме того, активно растущие культуры обладают лучшей защитной способностью против добавленной перекиси, чем находящиеся на хранении спящие культуры, которые могут оказаться более подверженными повреждениям. Поэтому, несмотря на то, что пробирки с косым агаром и пробирки с дистиллированной водой могут быть легко приготовлены с перекисью, хранение штаммов без перекиси видится более безопасным. Приготовить пробирки с чистой дистиллированной водой очень просто. Разлейте воду по пробиркам, слегка накрутите колпачки и простерилизуйте пробирки в скороварке в течение получаса. Если у вас нет скороварки, попробуйте прокипятить пробирки в течение часа, добавив в них по несколько капель 3 % перекиси. Перекись убьет термоустойчивые споры, а длительное кипячение разрушит перекись. В отличие от чашек петри, пробирки можно держать над пламенем при открывании и закрывании, что помогает сохранить стерильность без фильтрации атмосферы при переносах мицелия. Подготовленные к хранению пробирки я заворачиваю в пищевые пластиковые пакеты и отношу в подвал, где для их содержания предусмотрено безопасное место.
Инокуляция и уход за агаровыми культурами
Я провожу инокуляцию свежих чашек и пробирок, перенося в них с помощью скальпеля, простерилизованного в пламени спиртовки, небольшие кусочки обросшего мицелием агара, взятого из чашки, освоенной здоровой культурой. При использовании нагретого скальпеля для вырезания кусочков агара, я сперва охлаждаю скальпель, погружая его в агар на чашке, которая служит источником мицелия для переноса. Традиционный метод подразумевает охлаждение скальпеля путем погружения в агар на свежей, неиспользованной чашке. Нагретый скальпель может вызвать разложение перекиси в месте его погружения в агар. В нефильтрованном воздухе это место, будучи защищенным в меньшей степени, может стать исходной точкой для роста вредоносных микроорганизмов. Данное обстоятельство не является проблемой для чашки, из которой я произвожу перенос, потому что дальнейшее ее использование не предусмотрено. К свежей чашке указанная проблема относится в гораздо большей степени. Вот почему я охлаждаю скальпель в колонизированной чашке.
Если вы инокулируете чашку с использованием культуры, свободной от перекиси, не применяйте инокуляционную петлю, за исключением тех случаев, когда требуется выудить большой фрагмент мицелия. По моему опыту, незначительные фрагменты мицелия, извлеченные с помощью инокуляционной петли, не способны легко основать колонию в присутствии перекиси в концентрации, эффективной для борьбы с заражениями, особенно если используемая культура не была выращена в присутствии перекиси. Мицелий имеет гораздо лучшие шансы на приживание, если его сгусток взят из пробирки с дистиллированной водой или кусочек агара с мицелием извлечен из пробирки при помощи скальпеля или другого заостренного инструмента (признаюсь, что доставать кусочки агара из пробирки при помощи скальпеля, по меньшей мере, неудобно).
Культуры, которые предварительно не подвергались воздействию перекиси, зачастую «замирают» на некоторое время, в течение которого мицелий адаптируется к новым условиям среды. Иногда мицелий начинает расти по направлению от перекисного агара. Подобное поведение можно наблюдать, когда производится перенос мицелия из чашки, первоначально содержавшей перекись, который затем подвергся разложению после полного освоения всей поверхности агара мицелием и последующей избыточной инкубации в течение нескольких дней. Тем не менее, рано или поздно мицелий адаптируется к новым условиям и начнет нормальный рост по всей поверхности свежей среды.
У меня никогда не было проблем со штаммами, которые длительное время находились в присутствии перекиси. Обычно я осуществляю до десяти переносов мицелия на перекисесодержащую среду, после чего возвращаюсь к эталонным культурам, хранящимся без перекиси, хотя мой выбор
