исследователи могли наблюдать, как со временем менялся их геном.
Они обратили внимание, что бактерии, собранные вскоре после крупной вирусной атаки, обзавелись спейсерами с последовательностями, взятыми из этих вирусов, а это свидетельствовало, что их интеграция в геном произошла для отражения будущих атак. Поскольку иммунитет теперь стал частью ДНК бактерий, он передавался всем последующим поколениям этих бактерий. В мае 2005 года ученые провели сравнение и поняли, что достигли цели. “Мы увидели стопроцентное совпадение между CRISPR бактериального штамма и последовательностью вируса, атаковавшего его, – вспоминает Баррангу. – Таким стал наш момент истины” [92]. Они получили весомое подтверждение тезиса, сформулированного Франсиско Мохикой и Евгением Куниным.
Затем они совершили весьма полезный шаг: они показали, что могут искусственно создавать такой иммунитет, конструируя и внедряя в геном собственные спейсеры. Во французской исследовательской лаборатории нельзя было заниматься генной инженерией, поэтому эту часть экспериментов Баррангу провел в Висконсине. “Я продемонстрировал, что при добавлении последовательностей из вируса в локус CRISPR бактерия вырабатывает иммунитет к этому вирусу”, – говорит он [93]. Кроме того, ученые доказали, что CRISPR-ассоциированные ферменты (ферменты Cas) играют важнейшую роль в приобретении новых спейсеров и защите от атакующих вирусов. “По сути, я отключил два гена Cas, – поясняет Баррангу. – Двенадцать лет назад это было непросто. Одним из них был Cas9. Мы показали, что стоит его отключить, как сопротивляемость пропадает”.
В августе 2005 года они использовали свои открытия, чтобы подать заявку и получить один из первых патентов, связанных с системами CRISPR-Cas. В тот же год Danisco начала использовать CRISPR для вакцинации своих бактериальных штаммов.
Баррангу и Хорват написали для журнала Science статью, опубликованную в марте 2007 года. “Момент был прекрасен, – говорит Баррангу. – Мы, сотрудники неведомой датской компании, отправили статью с описанием малоизвестной системы организма, до которого ни одному ученому нет дела. Мы были бы безмерно рады и одной рецензии. Но статью приняли к публикации!” [94]
Конференции по CRISPR
Статья помогла вывести интерес к CRISPR на новый уровень. Джиллиан Бэнфилд, биолог из Беркли, которая привлекла Даудну к сотрудничеству в кафе Free Speech Movement, немедленно связалась с Баррангу. Они решили поступить так, как часто поступают пионеры новых областей науки: организовать ежегодные конференции. Первая из них, подготовленная силами Бэнфилд и Блейка Виденхефта, состоялась в конце июля 2008 года в Стэнли-холле в Беркли, где находилась лаборатория Даудны. На ней присутствовало всего тридцать пять человек, включая Франсиско Мохику, который прилетел из Испании, чтобы выступить с докладом.
В науке не возникает проблем с сотрудничеством на расстоянии – и особенно в нем преуспевают ученые, которые занимаются исследованиями CRISPR, как показали на своем примере Хорват и Баррангу. Но в непосредственной близости порой происходят более сильные реакции: идеи рождаются за чаем в таких местах, как кафе Free Speech Movement. “Не будь этих конференций по CRISPR, эта область не развивалась бы с такой скоростью и не стала бы ареной для такого плодотворного сотрудничества, – говорит Баррангу. – И не возникло бы никакого чувства локтя”.
Правила на конференции были не слишком строгими, а атмосфера – доверительной. Участники неформально рассказывали о результатах, которые еще не опубликовали, а другие ученые не пытались извлечь из этого выгоду. “Небольшие конференции, на которых люди делятся неопубликованными данными и идеями и каждый помогает каждому, могут изменить мир”, – отметила впоследствии Бэнфилд. Первым делом на конференции стандартизировали терминологию и названия, в том числе разработав единую систему наименования CRISPR-ассоциированных белков. Сильвен Моро, один из первых участников мероприятий, назвал июльский конгресс “научной рождественской вечеринкой” [95].
Сонтхаймер и Марраффини
В год первой конференции произошел значительный прорыв. Лучано Марраффини и его научный руководитель Эрик Сонтхаймер из Северо-Западного университета в Чикаго продемонстрировали, что мишенью системы CRISPR является ДНК. Иными словами, CRISPR работает не посредством РНК-интерференции, как было принято считать тогда, когда Бэнфилд впервые вышла на связь с Даудной. На самом деле система CRISPR была нацелена на ДНК атакующего вируса [96].
Это имело поразительное следствие. Марраффини и Сонтхаймер поняли, что если система CRISPR нацелена на ДНК вирусов, то в таком случае ее можно превратить в инструмент для редактирования генома. Их судьбоносное открытие еще сильнее подогрело интерес к CRISPR по всему миру. “Отсюда вытекала идея, что CRISPR может обладать фундаментальными трансформирующими свойствами, – говорит Сонтхаймер. – Если [система] могла брать на прицел и разрезать ДНК, то она давала возможность исправлять причину генетической проблемы” [97].
Но чтобы использовать ее таким способом, сначала нужно было многое понять. Марраффини и Сонтхаймер точно не знали, как фермент CRISPR разрезает ДНК. Возможно, его метод осуществления процедуры был несовместим с редактированием генома. Тем не менее в сентябре 2008 года они подали заявку на патент для использования CRISPR в качестве инструмента редактирования ДНК. Заявку отклонили – и вполне обоснованно. Ученые верно предположили, что однажды систему можно будет использовать для редактирования генома, но пока это не подтверждалось никакими экспериментальными данными. “Невозможно запатентовать идею, – признает Сонтхаймер. – Нужно изобрести то, о чем говоришь”. Они также подали заявку на грант Национальных институтов здоровья, чтобы продолжить изучение потенциала CRISPR в качестве инструмента для редактирования генома. И эта заявка тоже оказалась отклонена. Но все же они вошли в историю как ученые, которые первыми предположили, что системы CRISPR-Cas могут применяться для редактирования генома [98].
Сонтхаймер и Марраффини изучали CRISPR в живых клетках, например в клетках бактерий. Аналогичные исследования проводили и другие специалисты по молекулярной биологии, которые в тот год опубликовали статьи о CRISPR. Однако, чтобы определить ключевые компоненты системы, нужен был другой подход: биохимикам необходимо было изучить молекулы in vitro, в пробирке. Изолируя компоненты в пробирке, биохимики могли на молекулярном уровне объяснить открытия, совершенные микробиологами in vivo, а также сделанные специалистами по вычислительной генетике при сравнении данных о секвенировании in silico.
Эрик Сонтхаймер и Лучано Марраффини
“Когда проводишь эксперименты in vivo, никогда точно не знаешь, почему происходят те или иные вещи, – признает Марраффини. – Мы не можем заглянуть внутрь клетки и увидеть, как все работает”. Чтобы в полной мере изучить каждый компонент, необходимо вынуть его из клетки и поместить в пробирку, где можно точно контролировать химический состав содержимого. Именно на этом специализировалась Даудна, и этим занимались в ее лаборатории Блейк Виденхефт и Мартин Йинек. “Было ясно, что для решения этих вопросов нам нужно выйти за рамки генетического исследования и применить скорее биохимический подход, – позже написала она, – который позволил бы нам
