другую cгРНК, чтобы в результате разрезать любую другую последовательность ДНК по нашему выбору”.
История науки знает не так уж много истинных озарений, но это было одно из них. “Нельзя сказать, что осознание пришло к нам постепенно, – вспоминает Даудна. – Все случилось внезапно”. Когда Йинек показал Даудне свои данные, демонстрирующие, что Cas9 можно программировать с другими направляющими РНК, чтобы резать ДНК в желаемых местах, ученые замолчали и переглянулись. “Боже мой, это может стать мощным инструментом для редактирования генома”, – заметила Даудна. Иными словами, они поняли, что разработали способ переписывать код жизни [140].
Одиночная направляющая РНК
На следующем этапе предстояло выяснить, можно ли еще больше упростить систему CRISPR. Если да, то она могла бы стать не просто очередным инструментом для редактирования генома, а инструментом, который легче поддавался бы программированию и был бы дешевле существующих методов.
Однажды Йинек пришел из лаборатории в кабинет Даудны. Он проводил эксперименты, чтобы определить минимальные требования к cгРНК, служившей проводником, и tracгРНК, которая привязывала ее к ДНК-мишени. Ученые стояли у белой доски перед столом Даудны, и Йинек рисовал схему строения двух малых РНК. Какие элементы cгРНК и tracгРНК играют ключевую роль при разрезании ДНК в пробирке? “Казалось, что система предполагает некоторую гибкость и длина фрагментов РНК может варьироваться”, – говорит Йинек. Каждую из малых РНК можно было сделать еще немного короче, но оставить при этом рабочей. Даудна прекрасно понимала структуру РНК и, как ребенок, радовалась возможности разобраться в механизмах ее работы. В процессе обсуждения ученым стало понятно, что они могут связать вместе две РНК, присоединив хвост одной из них к голове другой таким образом, чтобы итоговая молекула не потеряла функциональности.
Они хотели создать единую молекулу РНК, которая содержала бы и направляющую информацию с одной стороны, и идентификатор привязки с другой. В итоге получилась так называемая одиночная направляющая РНК (sдРНК). Сделав паузу, ученые переглянулись, а затем Даудна сказала: “Ничего себе”. “Такие моменты в науке приходят сами собой, – вспоминает она. – У меня по спине пробежал холодок и волоски на шее встали дыбом. В тот момент мы поняли, что у проекта, за который мы взялись из чистого любопытства, есть важное следствие, способное все в корне изменить”. И правда, можно представить, как поведение крошечной молекулы заставило волоски на шее у Даудны встать дыбом.
Даудна сказала Йинеку немедленно приступать к работе по соединению двух молекул РНК и созданию одиночной направляющей РНК для Cas9, и он поспешил обратно в лабораторию, чтобы заказать у поставщика необходимые молекулы РНК. Он также обсудил идею с Хылинским, и они быстро подготовили серию экспериментов. Когда они выяснили, какие фрагменты двух РНК можно удалить и как соединить РНК друг с другом, на создание работающей sдРНК ушло всего три недели.
Сразу стало очевидно, что одиночная направляющая РНК сделает CRISPR-Cas9 еще более универсальным, легким в использовании и программируемым инструментом для редактирования генов. Система с единой направляющей имела особенное значение – как с научной точки зрения, так и с позиции интеллектуальной собственности, – поскольку была изобретением человека, а не просто обнаруженным в природе феноменом.
К тому моменту сотрудничество Даудны с Шарпантье принесло два важных прорыва. Первым стало открытие, что tracгРНК играет ключевую роль не только в создании направляющей РНК, но и, что важнее, в удержании их вместе с ферментом Cas9 и привязке всей системы к ДНК-мишени для разрезания. Вторым – изобретение способа соединять две этих РНК в одиночную направляющую РНК. Изучая феномен, на совершенствование которого у бактерий ушли миллиарды лет эволюции, они превратили чудо природы в инструмент для людей.
В день, когда они с Йинеком придумали, как создать одиночную направляющую РНК, Даудна за ужином объяснила идею своему мужу. Поняв, что это может пригодиться для будущего патента на технологию редактирования генома, он посоветовал ей записать все в лабораторный журнал и засвидетельствовать. Тем же вечером Йинек вернулся в лабораторию и сделал подробное описание концепции. Было около девяти часов, но Сэм Стернберг и Рейчел Хорвиц еще не ушли. В нижней части на каждой странице лабораторных журналов отводится место для подписей свидетелей, необходимых при совершении важных открытий, и Йинек попросил Стернберга и Хорвиц расписаться. Поскольку к Стернбергу раньше не обращались с такой просьбой, он сразу понял, что этот вечер войдет в историю [141].
Когда настала пора писать статью о CRISPR-Cas9, Даудна и ее коллеги снова перешли на круглосуточную совместную работу, как и в период проведения экспериментов. Они разместили рукопись на хостинге Dropbox, где в реальном времени фиксировались все изменения, которые каждый из ученых вносил в файл. Йинек и Даудна работали, пока в Калифорнии был день, а поздно вечером связывались по скайпу с Европой, где только занималась заря, и на следующие двенадцать часов на арену выходили Шарпантье и Хылинский. Поскольку весной в Умео солнце не садится, Шарпантье сказала, что может работать в любое время суток. “Когда не темнеет, много не поспишь, – говорит она, – и особенной усталости в эти месяцы не чувствуешь, поэтому я всегда была в строю” [142].
Восьмого июня 2012 года Даудна нажала на кнопку “Отправить” на своем компьютере и представила рукопись на рассмотрение редакторам журнала Science. В списке авторов было шесть человек: Мартин Йинек, Кшиштоф Хылинский, Инес Фонфара, Майкл Хауэр, Дженнифер Даудна и Эмманюэль Шарпантье. Имена Йинека и Хылинского были отмечены звездочкой, и в примечании указывалось, что они внесли в работу одинаковый вклад. Даудна и Шарпантье были упомянуты последними, поскольку выступали в качестве ведущих исследователей, руководящих лабораториями [143].
В статье на 3500 слов подробно описывалось, как cгРНК и tracгРНК привязывают белок Cas9 к ДНК-мишени. В ней также демонстрировалось, каким образом структура двух доменов Cas9 определяет, как каждый из них разрезает последовательности ДНК в конкретном месте. Наконец, в ней объяснялось, как ученым удалось связать cгРНК и tracгРНК и синтезировать одиночную направляющую РНК. Авторы отмечали, что полученную систему можно использовать для редактирования генома.
Получив статью, редакторы Science обрадовались. Хотя многие аспекты работы CRISPR-Cas9 в живых клетках уже были описаны ранее, исследователям впервые удалось выделить отдельные компоненты системы и изучить их биохимические механизмы. Кроме того, в статье предлагалось потенциально полезное изобретение: одиночная направляющая РНК.
По настоянию Даудны редакторы ускорили процесс рецензирования. Даудна знала, что готово еще несколько статей о CRISPR-Cas9, в том
