футболки с логотипом Института инновационной геномики. Она быстро проверила, как идут эксперименты у каждого из ее студентов (и у меня), а затем ушла на весь день, чтобы заняться разработкой стратегии вместе с ведущими исследователями института.
В эксперименте, с которым мне помогал Нотт, использовался фрагмент ДНК, содержащий ген, способный делать бактерии устойчивыми к антибиотику ампициллину. В этом нет ничего хорошего, особенно если вы заражены такими бактериями. Нотт подготовил для меня Cas9 с направляющей РНК, разработанный для уничтожения гена. Все необходимое было сделано в лаборатории с нуля. “Нужный нам Cas9 закодирован в фрагменте ДНК, и любой, кто способен выращивать бактерии в лаборатории, может производить его в больших количествах”, – заверил меня Нотт. Должно быть, по выражению моего лица он понял, что я сомневаюсь, способен ли сам на такое. “Не беспокойтесь, – сказал он. – Если у вас нет желания делать все с нуля, можно просто купить Cas9 в интернете у таких компаний, как IDT. Можно даже купить направляющие РНК. Если вы хотите редактировать гены, нужные компоненты нетрудно заказать онлайн”.
(Позже я вышел в интернет и проверил его слова. На сайте IDT рекламируется продажа “всех реагентов, необходимых для успешного редактирования генома”, и стоимость наборов, созданных для доставки инструмента в человеческие клетки, начинается от 95 долларов. На сайте GeneCopoeia белок Cas9 с сигналом ядерной локализации стоит от 85 долларов.) [464]
Некоторые пробирки, подготовленные Ноттом, стояли в старомодном контейнере для льда, их используют, чтобы охлаждать реактивы. “У этого контейнера большая история”, – сказал Нотт и повернул его. На задней стенке стояло имя: “Мартин”. Контейнер принадлежал Йинеку, пока тот не уехал в Цюрихский университет, чтобы открыть там собственную лабораторию. “Он достался мне по наследству”, – с гордостью пояснил Нотт. Я почувствовал, что стал частью исторической цепочки. Эксперименты, которые мы собирались провести, повторяли опыты Йинека, поставленные в 2012 году: мы должны были взять фрагмент ДНК и инкубировать его с Cas9 и направляющей РНК, чтобы разрезать в нужном месте. Было здорово пользоваться при этом именно контейнером Йинека.
Нотт прошелся со мной по всем этапам эксперимента, показал, как с помощью пипеток смешать ингредиенты, и затем пояснил, что состав нужно выдержать в течение десяти минут. Мы добавили краситель, чтобы визуализировать результаты, и после этого смогли создать изображение того, что получили, прибегнув к процессу электрофореза, при котором разновеликие молекулы ДНК разделяются в геле под действием электрического поля. На итоговой фотографии видны полоски, находящиеся в разных местах геля, и на основе этого можно понять, удалось ли Cas9 разрезать ДНК и если да, то как именно. “Все получилось как по учебнику! – воскликнул Нотт, вынув фотографию из принтера. – Взгляните на разницу между этими полосками”.
По дороге из лаборатории я встретил у лифта мужа Даудны Джейми Кейта и продемонстрировал ему распечатки. Он показал на расплывчатые полоски в нижней части двух дорожек и спросил: “А это что такое?” Я знал ответ на этот вопрос (благодаря Нотту). “Это РНК”, – сказал я. Позже в тот же день Кейт опубликовал твит, в котором разместил нашу с Ноттом фотографию в лаборатории и написал: “Уолтер Айзексон ответил на мой контрольный вопрос!” На мгновение, пока я не осознал, что Нотт провел всю серьезную работу за меня, я почувствовал себя настоящим редактором генов.
Дженнифер Хэмилтон
Далее мне предстояло отредактировать ген в клетке человека. Иными словами, мне хотелось сделать то, что лабораториям Чжана, Черча и Даудны удалось в конце 2012 года.
С этим мне помогала другой постдок из лаборатории Даудны, Дженнифер Хэмилтон из Сиэтла, которая получила докторскую степень по микробиологии в Медицинском центре Маунт-Синай в Нью-Йорке. В больших очках, с широкой улыбкой, Хэмилтон с энтузиазмом приручает вирусы, которые доставляют инструменты для редактирования генома в клетки человека. Когда в 2016 году Даудна прилетела в Маунт-Синай, чтобы выступить с лекцией перед группой “Женщины в науке”, Хэмилтон была ее сопровождающей. “Мы с ней сразу поладили”, – вспоминает она.
Тогда Даудна только основала в Беркли Институт инновационной геномики, который впоследствии объединил исследователей из Области залива Сан-Франциско. Перед ним среди прочего стояла задача найти способы доставлять инструменты для редактирования генома на базе CRISPR в клетки человека, чтобы лечить болезни. Даудна предложила работу Хэмилтон. “Я умела конструировать вирусы и хотела применить свои навыки, чтобы разработать методы доставки CRISPR в организм человека”, – говорит Хэмилтон [465]. Ее специальность оказалась очень ценной, когда лаборатория после начала пандемии занялась исследованием коронавирусов, в связи с чем возникла необходимость найти новые способы доставлять препараты на основе CRISPR в клетки человека.
Когда мы приступили к нашей попытке отредактировать ДНК в клетке человека, Хэмилтон подчеркнула, что сделать это сложнее, чем в пробирке. Нити ДНК, которые я редактировал накануне с Ноттом, содержали всего 2,1 килобазы (2100 спаренных оснований ДНК), но в подготовленной для нашего эксперимента клетке, полученной из клетки почки человека, было 6,4 миллиона килобаз. “Сложность с редактированием генома человека состоит в том, – сказала Хэмилтон, – что необходимо провести инструменты для редактирования сквозь внешнюю плазматическую мембрану клетки и сквозь ее ядерную мембрану, чтобы доставить их туда, где находится ДНК, и после этого еще обеспечить, чтобы они нашли нужное место в геноме”.
Объяснение запланированной процедуры, данное Хэмилтон, казалось бы, поддерживало, хоть и невольно, довод Чжана о том, что перейти от редактирования ДНК в пробирке к редактированию ДНК в клетке человека совсем не просто. Впрочем, тот факт, что я собирался провести этот эксперимент, полагаю, можно было бы использовать в поддержку противоположной точки зрения.
Хэмилтон сказала, что мы сделаем двухцепочечный разрез в нужном месте ДНК клетки человека. Кроме того, мы должны были доставить туда шаблон для вставки нового гена. Исходная клетка была синтезирована таким образом, чтобы в ней был ген, производящий флуоресцентный белок, светящийся синим. В ходе одной из процедур мы планировали применить инструмент CRISPR-Cas9, чтобы разрезать этот ген и таким образом отключить его. После этого клетка должна была перестать светиться. Работая с другим образцом, мы собирались доставить в клетку шаблон, в соответствии с которым в ДНК клетки должны были измениться три спаренных основания, после чего цвет флуоресцентного белка сменился бы с синего на зеленый.
Метод, который мы использовали, чтобы доставить CRISPR-Cas9 и шаблон в ядро клетки, называется нуклеофекцией. Он задействует электрические импульсы, чтобы сделать мембраны клетки более проницаемыми. По завершении процесса редактирования я посмотрел в флуоресцентный микроскоп и увидел результат. Контрольная группа по-прежнему светилась синим. Группа, разрезанная с помощью CRISPR-Cas9
