Перейдем теперь от модели к реальности и познакомимся с недавно открытой группой таких «избыточных» регуляторов — теневыми энхансерами.
Майкл Левин и его коллеги из Калифорнийского университета в Беркли (США) много лет изучают работу генов — регуляторов раннего развития у дрозофил. Одним из таких генов является транскрипционный фактор Dorsal (DL), отвечающий за разделение брюшной и спинной стороны у ранних эмбрионов дрозофил. Исследования Левина с коллегами показали, что DL имеет сотни сайтов связывания, рассыпанных по всему геному, т. е. активирует экспрессию сотен генов. Сайты связывания DL входят в состав примерно 40 сложных энхансеров — комплексов из нескольких сайтов связывания ТФ (в широком смысле энхансером иногда называют и одиночный сайт связывания ТФ). Подтвердить функциональность энхансеров удалось с помощью трансгенных эмбрионов с удаленными участками ДНК. С помощью этих мутантов ученые выяснили, какие из нуклеотидных последовательностей действительно работают в качестве энхансеров, регулируемых белком DL.
Но оказалось, что у генов, подчиненных DL, может быть даже не по одному, а по два энхансера. Как правило, энхансеры находятся вблизи (в пределах нескольких тысяч пар нуклеотидов) начала белок-кодирующей части гена. Но в случае с DL-зависимыми генами их энхансеры могут располагаться и далеко, в десятках тысяч пар нуклеотидов от места начала транскрипции, и вблизи других, индифферентных к DL, генов или даже внутри них. Эти необычные энхансеры были названы теневыми. Соседние с теневыми энхансерами гены начинают экспрессироваться уже на более поздних стадиях развития, поэтому очевидно, что «ранний» транскрипционный фактор DL не имеет к ним отношения. Отключив основные энхансеры мутациями, ученые показали, что их скрытые двойники обеспечивают сходную картину экспрессии генов (т. е. теневые энхансеры дублируют функции основных).
Чтобы оценить изменчивость энхансеров, ученые построили эволюционные деревья по 12 близким видам дрозофил отдельно для теневых и основных регуляторных элементов. По длине ветвей получившихся деревьев оценили скорость мутирования у основных и теневых энхансеров. Оказалось, что теневые энхансеры мутировали в среднем в 1,6 раза чаще, чем основные.
Это значит, что теневые энхансеры более изменчивы и, таким образом, представляют больше материала для отбора. Они могут менять степень своего сродства к тем или иным ТФ, подстраивая системы организма к меняющимся условиям.
По-видимому, теневые энхансеры появляются в результате дупликаций некодирующих участков генома. Дублирование регуляторных участков ДНК позволяет «избыточным» участкам свободнее накапливать мутации — точно так же, как это происходит при дупликации целых генов. Бессмысленные мутации в дубликате не нарушат экспрессию подконтрольного гена, так как его нормальное функционирование поддерживается основными энхансерами. Полезные мутации при этом могут стать запасным вариантом или начать работать в нестабильных или новых условиях. По мнению Левина и его коллег, появление новой копии регуляторного участка может стать первым этапом формирования нового адаптивного признака или нового вида (Hong et al., 2008).
Поиск и выявление функций энхансеров требует применения самых «навороченных» молекулярных технологий и колоссальных усилий со стороны исследователей. Пока это очень сложный путь со множеством препятствий, но он помогает понять реальную роль регуляторных последовательностей в онтогенезе и эволюции.
Дальнейшие исследования подтвердили, что теневые энхансеры только кажутся избыточными. На самом деле (как читатели, конечно, уже догадались) они нужны для того, чтобы сделать развитие более помехоустойчивым.
Теневой энхансер обычно срабатывает (т. е. включает свой ген) в тех же клетках эмбриона и в то же время, что и основной энхансер. Такое дублирование генной регуляции, как мы уже знаем, способствует эволюционным преобразованиям. Впрочем, существование теневых энхансеров нельзя объяснить только тем, что они дают больше свободы для эволюционных изменений. Естественный отбор не умеет заглядывать в столь отдаленное будущее. Теневые энхансеры должны выполнять какую-то полезную функцию здесь и сейчас, иначе они бы разрушились под грузом мутаций и не встречались бы с таким постоянством около генов — регуляторов онтогенеза.
Выяснить эту функцию удалось американским и французским генетикам в ходе изучения гена svb (shavenbaby), который управляет формированием щетинок у личинки дрозофилы (Frankel et al., 2010). Название гена, означающее в переводе «бритый младенец», показывает, что происходит, если ген выходит из строя. Регуляторная область гена svb принимает «входные сигналы» от нескольких генно-регуляторных каскадов. В результате совместного действия нескольких ТФ, связывающихся с расположенными в этой области сайтами связывания, ген svb включается в тех клетках эмбрионального эпидермиса, которые должны дать начало щетинкам.
В некодирующей области длиной в 50 тыс. пар нуклеотидов перед геном svb расположены три энхансера: 7, E и A. Их работа была изучена ранее (о методах поиска энхансеров мы говорили в главе 5 в разделе «Загадка узорчатых крыльев»). Совместное действие энхансеров 7, E и A полностью объясняет распределение областей экспрессии svb в эпидермисе эмбриона: ген включается там, где срабатывает хотя бы один из трех энхансеров.
Казалось бы, ген svb не нуждается ни в каких дополнительных регуляторах, кроме энхансеров 7, E и A. Однако ученые обнаружили, что у него есть два теневых энхансера, расположенных на большем удалении от кодирующей части гена. Эти энхансеры получили название DG2 и Z. Функция новооткрытых энхансеров полностью перекрывается с функцией трех регуляторных элементов, известных ранее (см. рисунок).
Как показали генно-инженерные эксперименты, оба теневых энхансера эффективно работают (т. е. включают присоединенный к ним ген там, где должны образоваться щетинки) у тех видов дрозофил, у которых есть щетинки этого типа (D. melanogaster, D. simulans) и не работают (испорчены мутациями) у вида, который в ходе эволюции эти щетинки утратил (D. sechellia). Три «обычных» энхансера у последнего вида тоже не работают.
Зачем нужны «избыточные» энхансеры? Чтобы ответить на этот вопрос, исследователи удалили из генома мух участок, содержащий теневые энхансеры. Это почти не повлияло на развитие щетинок: изменились только мелкие детали их строения. На здоровье личинок это не отразилось вовсе. Тем самым, казалось бы, подтвердилось предположение об избыточности теневых энхансеров. Однако дальнейшие эксперименты показали, что эта «избыточность» имеет важное приспособительное значение: она повышает стабильность эмбрионального развития в неблагоприятных условиях.
Личинки с удаленными теневыми энхансерами развиваются нормально только при температуре, оптимальной для личинок дрозофил (25 °C). Если же понизить температуру до 17 °C или повысить до 32 °C, то щетинки у мутантных личинок развиваются хуже. Ген svb удобен для таких исследований, потому что число щетинок на том или ином участке эпидермиса в точности отражает уровень экспрессии этого гена. Нормальные личинки, из генома которых теневые энхансеры не были удалены, имеют одинаковое количество щетинок при любой температуре от 17 до 32 °C. Дополнительные эксперименты подтвердили, что теневые энхансеры стабилизируют онтогенез, обеспечивая высокий уровень экспрессии гена svb независимо от колебаний температуры.
Нормальный ход развития может быть нарушен не только внешними неблагоприятными воздействиями, но и внутренними — например, мутациями важных регуляторных генов. Могут ли теневые энхансеры защитить работающий ген и от таких помех? Чтобы проверить это, авторы использовали мух, гетерозиготных по мутации, выводящей из строя важнейший регуляторный ген wingless. Ген svb находится под контролем нескольких регуляторных генов, в том числе wingless.
Оказалось, что для мух, у которых одна из двух копий wingless не работает, наличие теневых энхансеров является необходимым условием формирования нормальных щетинок. Если теневые энхансеры удалены, щетинки развиваются значительно хуже. Таким образом, теневые энхансеры обеспечивают устойчивую работу гена svb не только при колебаниях температуры, но и при мутационном повреждении вышестоящего генно-регуляторного каскада.
Регуляторный участок гена svb и области действия энхансеров. a — личинка дрозофилы, вид сбоку. Темным цветом показаны места, где развиваются щетинки. Ген svb управляет развитием одного из типов щетинок, которые занимают на каждом сегменте определенную область. На одном из брюшных сегментов эта область обведена черным контуром. б — расположение энхансеров в регуляторной области гена svb. Серый прямоугольник в правой части схемы — это начало (первый экзон) кодирующей части гена svb. Левее находятся три обычных энхансера (7, E, A), еще левее — два теневых энхансера (Z, DG2). Фигура, нарисованная под каждым энхансером, соответствует области формирования щетинок, которая обведена на верхнем рисунке. Для каждого энхансера показан район в пределах этой области, в котором он срабатывает. Из Frankel et al., 2010.
