Жизненный цикл фага
Различают фаги инфекционные, т. е. способные вызвать разные формы фаговой инфекции, и неинфекционные (вегетативные), или незрелые, фаги, находящиеся еще в стадии размножения. В свою очередь инфекционные фаги разделяют на покоящиеся (находящиеся вне клетки), вирулентные – способные вызвать продуктивную форму инфекции, и умеренные фаги – способные вызывать не только продуктивную, но и редуктивную фаговую инфекцию.
Жизненный цикл фага может проявляться в форме продуктивной (фаг размножается в клетке и выходит из нее), редуктивной (геном фага проникает в клетку, однако размножения фага не происходит, его геном интегрируется в хромосому клетки-хозяина, становится ее составной частью, т. е. фаг превращается в профаг, а клетка становится лизогенной) и абортивной инфекции, при которой взаимодействие фага с клеткой обрывается на какой-то стадии жизненного цикла фага, и он погибает.
Клетка, несущая профаг, называется лизогенной, потому что профаг, передающийся клеткой по наследству, может выйти из хромосомы, активироваться и вызвать продуктивную форму инфекции.
Если в результате лизогении, т. е. внедрения профага в хромосому клетки-хозяина, она получает новые наследуемые признаки, такую форму ее изменчивости называют лизогенной конверсией, т. е. изменчивостью, обусловленной лизогенией. Лизогенную конверсию вызывают только умеренные фаги.
Жизненный цикл фага, сопровождающийся продуктивной инфекцией, складывается из шести последовательных стадий, каждая из которых, в свою очередь, состоит из нескольких этапов.
1. Адсорбция фагов на клеточной поверхности бактерий при помощи специфических рецепторов (белков-лоцманов), которые располагаются на кончике нити, шипа или хвостика. В свою очередь, на клеточной стенке бактерии располагаются ее фагоспецифические рецепторы, распознаваемые фагом. Адсорбция фага – пусковой момент его жизненного цикла. Она очень специфична и поэтому обусловливает возможность практического использования фагов, например для идентификации бактерий, а также для лечебных и профилактических целей.
2. Проникновение фагового генома через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану внутрь клетки и освобождение его от оболочки (раздевание фага).
3. Установление фагового генома с помощью белка-лоцмана для реализации содержащейся в геноме информации:
а) однонитевая ДНК – к репликативному аппарату для синтеза комплементарной ей нити и образования репликативной формы; далее ее поведение аналогично двунитевой ДНК;
б) двунитевая ДНК – к транскрипционному аппарату для синтеза мРНК и последующей трансляции вирусспецифических белков (ферментов и структурных);
в) РНК-геном – к трансляционному аппарату для синтеза вирусспецифических белков (ферментов репликации и структурных).
4. Репликация фаговой геномной ДНК или РНК.
5. Сборка вновь синтезированных вирионов – заключение геномной НК в белковую оболочку, морфогенез фагов.
6. Выход вновь синтезированных фагов из клетки:
а) путем отпочковывания (М13 – единственный фаг, не вызывающий при выходе из клетки ее гибели);
б) путем лизиса клетки изнутри. Он осуществляется свободным лизоцимом и вызывает гибель клетки.
Степень зависимости репликации ДНК фага от хромосомы клетки определяется набором генов у фагов. Крупные фаги, например Т4, осуществляют репликацию полностью автономно; средние – Т7 – частично нуждаются в помощи бактериальных генов, а мелкие (М13, φX174) почти полностью зависят от хромосомных генов.
Жизненный цикл фага Т4 протекает следующим образом. С помощью своего хвостика фаг распознает специфический для него рецептор на поверхности клеточной стенки бактерий (чаще всего липополисахаридной природы) и прикрепляется к нему. Эта фаза адсорбции обратима, но затем, когда ворсинки раскрываются и плотно прикрепляют фаг к клеточной стенке, она становится необратимой. Пластинка со своими шипами прикрепляется к стенке, содержащийся в них лизоцим вызывает в месте контакта лизис клеточной стенки. Одновременно ионы Ca2+ активируют содержащуюся в белках чехла аденозинтрифосфатазу (АТФазу), и чехол сокращается. Его длина уменьшается в 2 раза, количество витков также уменьшается в 2 раза: вместо 24 их становится 10 – 12 (см. рис. 83). В результате сокращения чехла внутренний стержень прокалывает клеточную стенку в участке, разрушенном лизоцимом, и цитоплазматическую мембрану. Прокалывание происходит в участках напротив зон адгезии цитоплазматической мембраны и нижнего слоя пептидогликана. Таких зон около 200 – 300, их размер 20 – 30 нм.
Внедрение фаговой ДНК в клетку происходит с помощью следующих механизмов:
а) около 10 % ее активно впрыскивается во время сокращения чехла хвостика;
б) остальная часть фаговой ДНК втягивается в цитоплазму бактерий благодаря процессам транскрипции и работе трансляционного аппарата.
Внутриклеточное размножение фага Т2 происходит в такой последовательности: уже через 1 мин синтезируются ранние мРНК, кодирующие белки, необходимые для репликации фаговой ДНК; через 5 мин начинается репликация ДНК; затем – синтез мРНК, необходимых для образования структурных белков фага и его морфогенеза, а через 13 мин в клетке появляются первые вирионы. Процесс синтеза ДНК, белков и морфогенез фагов продолжается далее: из одного фага в клетке синтезируется 200 – 300 новых вирионов.
Особенности морфогенеза фагов. Морфогенез мелких фагов протекает по типу самосборки. У крупных фагов этот процесс носит более сложный характер. Например, морфогенез фага Т4 требует активности более чем 40 генов и протекает при участии трех самостоятельных линий. На одной из них происходит сборка хвостика (участвует около 20 генов), на другой – головки фага (не менее 16 генов) и на третьей – сборка ворсинок (5 генов). Соединение хвостика с головкой не требует участия генов, однако оно не может произойти до тех пор, пока и хвостик, и головка не будут смонтированы полностью. Точно так же ворсинки могут присоединяться к хвостику только после того, как он соединится с полностью готовой головкой. Благодаря строгому генетическому контролю со стороны фага обеспечивается последовательность и согласованность всех процессов его внутриклеточного размножения.
Выход сформировавшихся фагов в большинстве случаев происходит благодаря лизису изнутри свободным лизоцимом. Он синтезируется на самом последнем этапе размножения фага. Иногда бывает лизис бактерий извне как следствие адсорбции многих фагов на одной клетке, но при этом размножения фагов не происходит.
Обычно же после внедрения фагового генома в клетку у нее возникает состояние иммунитета к суперинфекции данным фагом, т. е. проникновение других фаговых геномов становится невозможным. Иммунитет обеспечивается особым цитоплазматическим репрессором.
Ее вызывают только умеренные фаги. В этом случае их жизненный цикл складывается из следующих стадий:
а) адсорбция фага на поверхности клетки;
б) проникновение фаговой ДНК в бактериальную клетку;
в) сайт-специфическая интеграция фаговой ДНК в хромосому клетки-хозяина и превращение фага в профаг.
Если первые две стадии протекают так же, как в случае продуктивной инфекции, то третья требует участия дополнительных фаговых и хозяйских генов.
Механизм интеграции фаговой ДНК в хромосому бактериальной клетки лучше всего изучен на примере фага λ (лямбда). Фаг состоит из головки и хвостика. Его геном представлен двунитевой линейной ДНК, имеющей «липкие» концы (избыточные нуклеотидные последовательности на противоположных концах нитей, комплементарные друг другу), поэтому она может переходить в кольцевую структуру, необходимую для ее включения в хромосому клетки-хозяина. ДНК фага λ имеет м. м. около 30 МД, содержит 46 500 нуклеотидных пар и несет 32 гена, 7 из которых кодируют головку, 11 – хвостик, а остальные играют регуляторную роль.
Фаг λ включается в хромосому E. coli между генами gal и bio с помощью сайт-специфической рекомбинации. Она оказывается возможной потому, что ДНК фага имеет особый участок – attP (англ. attachment phage – прикрепление фага). Такой же участок имеется и в хромосоме E. coli – attB. Он расположен между генами gal и bio. Участки att имеют сложную структуру и состоят из 250 нуклеотидов. В результате рекомбинации между attP и attB, протекающей по механизму кроссинговера, фаговая ДНК оказывается включенной в хромосому, причем слева она фланкирована участком attL (англ. left – левый), а справа – attR (англ. right – правый), которые образуются вследствие рекомбинации между attP и attB. Рекомбинация протекает с участием генов red фага и recA – бактерии. Для интеграции требуется также белок фага – продукт гена int (интеграза) и особый хозяйский белок интеграции. Таким образом, геном фага, интегрируясь в хромосому, превращается в профаг, а клетка становится лизогенной. Выходу профага из хромосомы препятствует цитоплазматический репрессор, который наделяет клетку одновременно иммунитетом против повторного инфицирования данным фагом. Синтез репрессора контролируется фагом. Однако профаг спонтанно или под воздействием различных факторов (химические вещества, облучение УФ, рентгеновскими лучами, повышенная температура) может выходить из хромосомы клетки и вызывать продуктивную инфекцию, заканчивающуюся лизисом клетки и выходом из нее вновь синтезированных вирионов. Механизм выхода (исключение фага) из хромосомы состоит в том, что происходит рекомбинация между attL и attR, в результате которой восстанавливаются attP и attB, а фаговая ДНК принимает кольцевидную структуру и исключается из хромосомы. Процесс выхода требует участия, помимо указанных выше белков, еще одного белка – продукта фагового гена xis (ген эксцизии, исключения).
