1) приготовление водного экстракта исследуемого материала и смешивание его с соответствующим объемом специфической сыворотки;
2) осаждение образующихся микропреципитатов центрифугированием;
3) негативное контрастирование иммунного преципитата фосфорно-вольфрамовой кислотой;
4) нанесение материала на сеточку;
5) просмотр препарата в электронном микроскопе.
Единственный недостаток этого метода заключается в его громоздкости, поэтому он не может быть использован для массовых исследований.
Вирусологический метод основан на выделении вирусов и их идентификации с использованием культур клеток или куриных эмбрионов. Для проведения вирусологического исследования важное значение имеют: выбор материала и его предварительная обработка, условия транспортировки и соблюдение необходимых условий для культивирования вируса. Материал для исследования определяется характером вирусного заболевания, местом размножения вируса в организме и путями его выделения. Далее в соответствующих главах указано, при каких заболеваниях какой материал необходимо брать для выделения вируса. Для подавления возможного роста бактерий исследуемый материал обрабатывают антибиотиками, или последние (в определенных концентрациях) добавляют в питательную среду для выращивания культуры клеток. Выбор способа культивирования (заражение лабораторных животных, куриных эмбрионов или культур клеток) определяется биологией предполагаемого возбудителя. Важное значение имеет соблюдение стандартных условий культивирования: оптимальная температура, продолжительность, использование дополнительных тестов для индикации (бляшкообразование, реакции гемадсорбции, гемагглютинации, иммунофлуоресценции и т. д.). Методы индикации вирусов указаны в главе 44.
Для идентификации вирусов применяются типоспецифические сыворотки.
Серологические методы могут быть использованы для обнаружения в исследуемом материале как специфических антител, так и вирусных антигенов. Для этих целей могут быть использованы все известные серологические реакции:
1. Реакция связывания комплемента.
2. Реакция пассивной гемагглютинации и ее варианты (РНАг, РНАт).
3. Реакция торможения гемагглютинации.
4. Реакция гемагглютинации иммунного прилипания (комплекс антиген + антитело в присутствии комплемента адсорбируется на эритроцитах).
5. Реакции преципитации в геле.
6. Реакции нейтрализации вирусов.
7. Радиоиммунный метод.
8. Методы иммуноферментного анализа.
Из перечисленных методов все большей популярностью пользуются методы иммуноферментного анализа, отличающиеся высокой специфичностью и удобством использования.
Иммунофлуоресцентный метод, применяемый в прямом и обратном вариантах, является методом ускоренной диагностики.
Биологический метод основан на использовании животных, чувствительных к соответствующему вирусу.
Метод гибридизации ДНК-ДНК, или метод ДНК-зондов – один из наиболее перспективных способов исследования в современной биологии и медицине. Он может быть использован для выявления любых генов, любых фрагментов нуклеиновых кислот. В его основе лежит способность однонитевых молекул нуклеиновых кислот вступать во взаимодействие с комплементарными нитями и образовывать двунитевые гибридные молекулы. Гибридизация осуществляется или в растворах, или, чаще всего, на твердых подложках, таких, например, как нитроцеллюлозная мембрана. Исследуемую клеточную суспензию лизируют для высвобождения нуклеиновых кислот. После этого двухцепочечную ДНК предварительно денатурируют, а образующиеся одноцепочечные молекулы переносят на мембрану, где они ковалентно связываются с ДНК-зондом, который представляет собой меченные изотопом или ферментом денатурированные молекулы нуклеиновой кислоты. Гибридизация происходит лишь в том случае, если между зондом и иммобилизованной на мембране нитью ДНК имеется гомология.
Методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и геномной дактилоскопии описаны на с. 27, метод однопробирочного варианта реакции обратной транскрипции в сочетании с ПЦР – на с. 337.
Глава 49
Особенности противовирусного иммунитета
В основе некоторых существенных различий механизмов защиты организма от вирусов и бактерий лежат особенности биологии этих возбудителей.
В защите организма от вирусов участвуют все системы иммунитета, однако противовирусный иммунитет имеет существенные специфические черты. Они определяются тем, что в первую очередь на проникновение вируса в организм реагируют не системы комплемента и макрофагов, а системы интерферонов и Т-киллерных клеток. Другая особенность формирования иммунитета связана с тем, что вирусы оказывают слабое антигенное воздействие на В-лимфоциты и для их активирования, пролиферации и дифференцировки необходимо участие Т-хелперов и соответственно представление последним процессированного вирусного антигена (пептидных фрагментов) при участии молекул МНС класса II. Поэтому роль макрофагов и других антигенпредставляющих клеток заключается не столько в самом фагоцитозе, сколько в процессировании и представлении антигена.
Еще одна особенность противовирусного иммунитета обусловлена структурной организацией некоторых вирионов. Вирусы могут вызвать заболение лишь в том случае, если проникают в клетку. Для прикрепления к ней они используют клеточные рецепторы, которые клетка использует для собственных физиологических целей. Все идентифицированные вирусспецифические рецепторы – гликопротеиды или сиалогликолипиды. Вирус «узнает» специфические рецепторы и прикрепляется к ним с помощью своих прикрепительных белков VAP (англ. virion attachment proteins). Именно они играют роль своеобразных лоцманов, направляющих движение вируса в клетку. У некоторых вирусов молекулы этих белков-лоцманов расположены в скрытых местах – «щелях», «каньонах», т. е. углублениях на поверхности вириона. Их диаметр (глубина) у вирусов гриппа, полиомиелита, ВИЧ не превышает 2,5 нм. Диаметр же активного центра молекулы антитела составляет 3,5 нм, поэтому антитело не может связаться с белком-лоцманом вируса и блокировать его. В результате вируснейтрализующая активность антител ослабляется. На проникновение вируса раньше всего реагирует система интерферонов, которые подавляют внутриклеточное размножение вирусов. Кроме того, противовирусное действие оказывают находящиеся в сыворотке крови α– и β-ингибиторы. Альфа-ингибитор – термостабильный субстрат, входит в состав α-глобулинов, препятствует адсорбции вирусов на клетке, разрушается нейраминидазой орто– и парамиксовирусов. Бета-ингибитор – термолабильный мукопептид, входит в состав β-глобулинов, подавляет размножение орто– и парамиксовирусов.
Однако интерферонов и ингибиторов оказалось недостаточно для защиты от вирусов, поэтому природа создала против вирусов другой, очень мощный механизм защиты на уровне организма. Он представлен прежде всего Т-цитотоксическими лимфоцитами и другими киллерными клетками. Эти клетки распознают все чужеродные антигены, в том числе и вирусные, предсталяемые им молекулами МНС класса I. Главное биологическое значение Т-киллерных клеток и заключается в обнаружении и уничтожении любых клеток, инфицированных чужеродными антигенами.
Синтез антител связан, в свою очередь, с системой фагоцитов, В– и Т-лимфоцитов и МНС. В-лимфоциты с помощью иммуноглобулиновых рецепторов распознают соответствующий антиген и отвечают на него синтезом рецепторов, необходимых для распознавания сигналов от Т-хелперов. Активированные Т-хелперы синтезируют и секретируют факторы активации, пролиферации и дифференциации В-лимфоцитов. В результате их действия из активированных В-лимфоцитов формируются клоны антителообразующих клеток и клеток памяти (соответственно возникают и клоны клеток памяти Т-лимфоцитов).
Защитная роль антител в противовирусном иммунитете состоит главным образом в том, что они, взаимодействуя с вирусными рецепторами, исключают возможность адсорбции вирусов на мембране клеток и таким образом нейтрализуют их активность, делают невозможным проникновение вируса в клетку. Только таким путем, т. е. исключая возможность проникновения вируса в клетку, антитела обеспечивают формирование приобретенного иммунитета. Приобретенный противовирусный иммунитет при наличии постоянных клонов клеток памяти может сохраняться пожизненно. Помимо способности нейтрализовать вирусы, антитела выполняют большую роль в освобождении организма от вирусов и вирусных антигенов. Связываясь с ними, антитела образуют иммунные комплексы, которые выводят эти антигены из организма. Эффективность антител в формировании приобретенного иммунитета против вирусных инфекций подтверждена многолетней практикой специфической профилактики полиомиелита, кори, желтой лихорадки, других инфекций и полной ликвидацией на Земле натуральной оспы.
