Введенный первоначальником пустыни строгий общежительный устав, составленный по образцу Афонского, хранился и при его преемниках: отцах Дорофее, Филарете, Ефреме, Пахомии, Исаии I, Исаии II, Нифонте, которые все были духовно опытными и учительными наставниками братии. Среди монахов Саровской пустыни немало было подвижников высокой духовности. Иеромонах Иоаким (1732-1802) провел в обители около 50 лет, нес в ней послушание псаломщика и библиотекаря, много времени посвящал переписыванию аскетических творений преподобных Макария Великого, Ефрема Сирина и других святых отцов. За советом и наставление к нему обращались не только иноки, но и богомольцы, для которых Саров стал святым местом. До перевода на Валаам в пустыни подвизался старец Назарий (1735-1809), здесь же провел он и свои последние годы. Большой славой в народе пользовался и Саровский инок Марк Пустынник (†1817).
Но самым ярким светочем Саровской пустыни стал преподобный Серафим (в миру Прохор Исидорович Мошнин). Он родился 19 июля 1759 года в семье курского купца, который рано умер, оставив трехлетнего сына на попечение матери. Исидор Мошнин был богобоязненен и нищелюбив. Он занимался каменными подрядами по строительству домов и храмов. После его кончины вдова продолжала вести начатое мужем строительство нового храма во имя преподобного Сергия.
Однажды Агафия взяла с собой семилетнего мальчика на стройку. Они поднялись на недостроенную колокольню, и Прохор упал с нее. Сбежав в ужасе вниз, мать нашла сына живым и невредимым. В спасении мальчика она увидела особое смотрение Божие о нем. Через несколько лет после этого происшествия Прохор тяжко заболел, и когда был уже при смерти, в сонном видении ему явилась Пресвятая Богородица и обещала посетить и исцелить его. Вскоре по городу пронесли крестным ходом Курскую-Коренную икону Божией Матери Знамение, мать вынесла больного сына на руках к иконе. Он приложился к ней, и после этого быстро поправился.
Прохор с детства любил церковные службы и храм. Выучившись грамоте, он читал сверстникам вслух Священное Писание и жития святых. В отрочестве он сблизился с чтимым в Курске юродивым, и под его влиянием у него окрепло намерение оставить мир. В 16 лет он отпросился у матери уйти в монастырь. Агафия благословила его медным распятием, которое он свято хранил всю жизнь и носил его на груди. Вначале юноша вместе с богомольцами отправился в Киев на поклонение Печерским угодникам. Живший в Китаевской пустыни возле Лавры прозорливый затворник схимонах Досифей благословил ему идти в Саров. Вернувшись в Курск и простившись с матерью и родными, юноша отправился в Саровскую пустынь, и пришел туда 20 ноября 1778 года при настоятеле старце Пахомии.
Отец Пахомий ласково принял Прохора и отдал его в научение казначею обители иеромонаху Иосифу. Под его руководством Прохор проходил послушание в хлебне, просфорне, столярне, нес обязанности пономаря и все исполнял с усердием и послушанием. По примеру других иноков, в свободное время он уходил в лес и в полном уединении творил молитву Иисусову.
В 1780 году послушник заболел водянкой ― тело его распухло, больной испытывал тяжкие страдания в течение трех лет. Собратия хотели вызвать к нему врача, но Прохор попросил не делать этого, сказав: «Я предал себя Истинному Врачу душ и телес Господу нашему Иисусу Христу и Пречистой Его Матери». Старец Иосиф отслужил о его здравии Всенощную и Литургию. Прохор исповедался и приобщился Святых Христовых Тайн. После причастия ему было видение: в несказанном свете явилась Божия Матерь с апостолами Петром и Иоанном и, указав на больного, сказала: «Сей от рода нашего». Богородица возложила руку на его голову и вскоре после этого он выздоровел. На месте явления была построена больничная церковь с приделом во имя преподобных Зосимы и Саввания Соловецких. Престол для придела исцеленный соорудил своими руками из кипарисового дерева, и причащался в нем Святых Тайн.
После восьми лет послушничества, в 1786 году Прохор был пострижен в мантию с наречением имени Серафим. Через год его рукоположили в иеродиакона, и шесть лет он оставался в этом сане. Служил почти каждый день. Ночи под воскресные и праздничные дни проводил без сна, в молитве. Господь удостоил его благодатных видений во время церковных служб, не раз он видел ангелов, сослуживших иереям.
Однажды за Литургией в Великий четверг преподобный лицезрел Спасителя в окружении Небесных сил, идущего от западных дверей храма к алтарю. Дойдя по воздуху до амвона, Господь благословил служащих и молящихся и вступил в местный образ справа от Царских врат. Охваченный духовным восторгом, преподобный Серафим не мог сказать ни слова. Его под руки увели в алтарь, где он простоял неподвижно три часа. После видения он усилил подвиги и ночи проводил в молитве в лесной келлии за стенами монастыря.
2 сентября 1793 года в Тамбове святой Серафим был рукоположен в сан иеромонаха, и с этого дня стал служить ежедневно. После кончины настоятеля отца Пахомия, преподобный Серафим по его предсмертному благословению и с согласия нового настоятеля удалился в пустынную келлию в дремучем лесу. Одежда его была самой убогой, на голове ― поношенная скуфья, на плечах ― балахон из белого полотна, на ногах ― кожаные бахилы и лапти, а на груди ― медный материнский крест. А за плечами в сумке он неразлучно носил Евангелие. В течение недели святой прочитывал Новый Завет, читал святоотеческие и богослужебные книги, выучил наизусть много песнопений и воспевал их, работая на огороде или в лесу. Питался он один раз в день, а в среду и пятницу совершенно воздерживался от пищи. В первую неделю Великого поста преподобный не принимал пищи до субботы.
В монастырь он приходил по субботам и под праздники на Всенощную и Литургию. Навещавшие его пустынножитель схимонах Марк и иеродиакон Александр заставали его часто неподвижным, ничего не слышащим и не видящим, погруженным в умную молитву. В летнюю жару преподобный Серафим собирал мох для удобрения огорода на болоте, где его нещадно кусали комары. Около трех лет он питался только травой снитью, которая росла вокруг келлии. Кроме братии, к преподобному начали приходить и миряне за советом и утешением. Это нарушало его уединение, и святой старался избегать посещений. Встретив кого-нибудь в лесу, он кланялся и отходил, ибо, как он говорил впоследствии, «от молчания никто никогда не раскаивался». По его молитве дорогу в келлию преградили сучья вековых сосен. С этих пор его келлию, кроме монахов, посещали только птицы и дикие звери. Преподобный инок из рук кормил приходившего к нему за хлебом медведя, которого не раз видели издали возле старца.
Враг спасения ополчился на инока искушениями. Пустыннику представлялось, что его келлия рушится на четыре стороны и к нему рвутся звери с диким ревом. Но эти искушения он побеждал силою крестного знамения. Три года, больше тысячи ночей, оп простоял в молитве на гранитном камне, который лежал на полпути от келии в пустынь, взывая: «Боже, милостив буди мне грешному», а днем молился у себя в келлии, и тоже на камне, который принес из леса. Когда мысленная брань утихла, столпник сошел с камня, но с тех пор не оставляла его болезнь в ногах.
12 сентября 1804 года, когда старец рубил в лесу дрова, на него напали разбойники, потребовавшие у него денег. Святой ответил: «Я ни от кого ничего не беру». В руках у него был топор, но он опустил его, сложил руки на груди и сказал: «Делайте, что вам надобно». Разбойники стали избивать преподобного, обухом проломили ему голову, сломали ребра, топтали ногами. Связав его веревками, они бросились к нему в келлию искать деньги и драгоценности, но кроме иконы нашли лишь несколько картофелин, и в страхе убежали. Придя в сознание, преподобный дополз в келлию и пролежал в ней всю ночь, а наутро встал и с великими муками добрался до монастыря. Врачи, вызванные к нему, удивились, что он не умер от столь тяжких ран. Исцеление он опять получил от Царицы Небесной, как любил называть Божию Матерь святой старец, явившуюся ему в видении с апостолами Петром и Иоанном. Разбойников вскоре схватили, но преподобный Серафим просил начальство простить их. Он сказал, что если их накажут, то навсегда уйдет из Сарова. В скором времени пожар уничтожил дома злодеев, которые были из местных крестьян. Они раскаялись и впоследствии, приходили к старцу за благословением и советом.
После этого злоключения преподобный почти полгода провел в монастыре, но, поправившись, опять ушел в лесную келлию. Оставшись навсегда согбенным после этих истязаний, он ходил, опираясь на посох или топорик. После кончины игумена Исаии, братия просили его взять на себя настоятельство, но святой со смирением отказался от этой чести. Он приступил тогда к подвигу безмолвия: если ему в лесу встречался человек, он падал ниц и не вставал, пока тот не уходил. Старец перестал посещать обитель даже в воскресные дни. Раз в неделю монах приносил ему пищу, ставил ее в сенях на землю и уходил. Не встречаясь со святым.
