Жизнь юного Прохора до пострижения в монашество ежедневно распределялась так: в определённые часы он был в церкви на богослужении и правилах. Подражая старцу Пахомию, он являлся как можно раньше на церковные молитвы, выстаивал неподвижно всё богослужение, как бы продолжительно оно ни было, и никогда не выходил прежде совершенного окончания службы. В часы молитвы всегда стоял на одном определённом месте. Для предохранения от развлечения и мечтательности, имея глаза опущенными долу, он с напряжённою внимательностью и благоговением слушал пение и чтение, сопровождая их молитвою. Прохор любил уединяться в своей келии, где у него, кроме молитвы, были занятия двух родов: чтение и телесный труд. Псалмы он читал и сидя, говоря, что утруждённому это позволительно, а св. Евангелие и послания Апостолов всегда стоя пред св. иконами, в молитвенном положении, и это называл бдением (бодрствованием). Постоянно он читал творения св. отцов, напр. Шестоднев св. Василия Великого, беседы св. Макария Великого, Лествицу преп. Иоанна, Добротолюбие и проч. В часы отдохновения он предавался телесному труду, вырезывал кресты из кипарисного дерева для благословения богомольцам. Когда Прохор проходил столярное послушание, то отличался большим усердием, искусством и успехами, так что в расписании он один из всех назван Прохором — столяром. Он также ходил на общие для всей братии труды: сплавлять лес, приготовлять дрова и т.п.
Видя примеры пустынножительства о. игумена Назария, иеромонаха Дорофея, схимонаха Марка, юный Прохор стремился духом к большему уединению и подвижничеству, а потому испросил благословение своего старца о. Иосифа оставлять монастырь в свободные часы и уходить в лес. Там он нашёл уединённое место, устроил сокровенную кущу и в ней совершенно один предавался богоразмышлению и молитве. Созерцание дивной природы возвышало его к Богу, и, по словам человека, бывшего впоследствии близким к старцу Серафиму, он здесь совершал правило, еже даде Ангел Господень Великому Пахомию, учредителю иноческого общежития. Это правило совершается в следующем порядке: Трисвятое и по Отче наш: Господи, помилуй, 12. Слава и ныне: приидите поклонимся — трижды. Псалом 50: Помилуй мя, Боже. Верую во единого Бога... Сто молитв: Господи Иисусе Христе, Сыне Божий, помилуй мя грешного и по сём: Достойно есть и отпуст.
Это составляло одно моление, но таких молитв надлежало совершить по числу суточных часов, двенадцать днём и двенадцать ночью. С молитвою он соединял воздержание и пост: в среду и пятницу не вкушал никакой пищи, а в другие дни недели принимал её только один раз.
В 1780 году Прохор тяжко заболел, и всё тело его распухло. Ни один врач не мог определить вида его болезни, но предполагали, что это сделалась водяная болезнь. Недуг длился в продолжение трёх лет, из которых не менее половины Прохор провёл в постели. Строитель о. Пахомий и старец о. Исаия попеременно ходили за ним и почти неотлучно находились при нём. Тут-то и открылось, как все, и прежде других начальники, уважали, любили и жалели Прохора, бывшего тогда ещё простым послушником. Наконец, стали опасаться за жизнь больного, и о. Пахомий настоятельно предлагал пригласить врача или, по крайней мере, открыть кровь. Тогда смиренный Прохор позволил себе сказать игумену: «Я предал себя, отче святый, Истинному Врачу душ и телес, Господу нашему Иисусу Христу и Пречистой Его Матери; если же любовь ваша рассудит, снабдите меня, убогого, Господа ради, небесным врачевством — причастием Св. Тайн». Старец Иосиф, по просьбе Прохора и собственному усердию, особо отслужил о здравии больного всенощное бдение и литургию. Прохор был исповедан и причащён. В скором времени он выздоровел, что весьма удивило всех. Никто не понимал, как мог он столь скоро оправиться, и только впоследствии о. Серафим открыл тайну некоторым: после причащения Св. Таин ему явилась Пресвятая Дева Мария, в несказанном свете, с Апостолами Иоанном Богословом и Петром и, обратясь к Иоанну лицем и указывая перстом на Прохора, Владычица сказала: «Этот Нашего рода!»
«Правую-то ручку, радость моя,— говорил о. Серафим церковнице Ксении,— положила мне на голову, а в левой-то ручке держала жезл; и этим-то жезлом, радость моя, и коснулась убогого Серафима; у меня на том месте, на правом бедре-то, и сделалось углубление, матушка; вода-то вся в него и вытекла, и спасла Царица Небесная убогого Серафима; а рана пребольшая была, и до сих пор яма-то цела, матушка, погляди-ка, дай ручку!» — «И батюшка, бывало, сам возьмёт, да и вложит мою руку в яму,— прибавляла матушка Ксения,— и велика же она была у него, так вот весь кулак и взойдёт!» Много душевной пользы принесла Прохору эта болезнь: дух его окреп в вере, любви и надежде на Бога.
В период послушничества Прохора, при настоятеле о. Пахомии, предприняты были в Саровской пустыне многие нужные постройки. В числе их на месте келии, в которой болел Прохор, строилась больница для лечения недужных и успокоения престарелых, и при больнице церковь о двух этажах с престолами: в нижнем во имя свв. Зосимы и Савватия, чудотворцев Соловецких, в верхнем — во славу Преображения Спасителя. Прохор после болезни, молодой ещё послушник, был посылаем за сбором денег в разные места на сооружение церкви. Благодарный за своё исцеление и попечение начальства, он с охотою понёс трудный подвиг сборщика. Странствуя по ближайшим к Сарову городам, Прохор был и в Курске, на месте своей родины, но не застал уже матери своей в живых. Брат Алексей, со своей стороны, оказал Прохору немалую помощь для построения церкви. Вернувшись домой, Прохор, как искусный столяр, построил собственными руками престол из кипарисного дерева для нижней больничной церкви в честь преподобных Зосимы и Савватия.
В течение восьми лет юный Прохор был послушником. Наружный вид его к этому времени изменился: будучи высокого роста, около 2 арш. и 8-ми вершков, несмотря на строгое воздержание и подвиги, он имел полное, покрытое приятною белизною, лицо, прямой и острый нос, светло-голубые глаза, весьма выразительные и проницательные; густые брови и светло-русые волосы на голове. Лицо его окаймлялось густою, окладистою бородою, с которою на оконечностях рта соединялись длинные и густые усы. Он имел мужественное сложение, обладал большими физическими силами, увлекательным даром слова и счастливой памятью. Теперь он прошёл уже все степени монастырского искуса и был способен и готов принять монашеские обеты.
13-го августа 1786 года, с соизволения Св. Синода, о. Пахомий постриг послушника Прохора в сан инока. Восприемными отцами его при пострижении были о. Иосиф и о. Исаия. При посвящении ему было дано имя Серафима (пламенный). 27-го октября 1786 года монах Серафим, по ходатайству о. Пахомия, был посвящён преосвященным Виктором, епископом Владимирским и Муромским, в сан иеродиакона. Он вполне предался новому своему, поистине уже ангельскому, служению. Со дня возведения в сан иеродиакона он, храня чистоту души и тела, в течение пяти лет и 9-ти месяцев, почти беспрерывно находился в служении. Все ночи на воскресные и праздничные дни проводил в бодрствовании и молитве, неподвижно стоя до самой литургии. По окончании же каждой Божественной службы, оставаясь ещё надолго в храме, он, по обязанности священно-диакона, приводил в порядок утварь и заботился о чистоте Алтаря Господня. Господь, видя ревность и усердие к подвигам, даровал о. Серафиму силу и крепость, так что он не чувствовал утомления, не нуждался в отдыхе, часто забывал о пище и питье и, ложась спать, жалел, что человек, подобно Ангелам, не может беспрерывно служить Богу.
Строитель о. Пахомий теперь ещё более прежнего привязался сердцем к о. Серафиму и без него не совершал почти ни одной службы. Когда он выезжал по делам монастыря или для служения, один или с другими старцами, то часто брал с собою о. Серафима. Так, в 1789-м году, в первой половине июня месяца, о. Пахомий с казначеем о. Исаией и иеродиаконом о. Серафимом отправились по приглашению в село Леметь, находящееся в 6-ти верстах от нынешнего города Ардатова, Нижегородской губ., на похороны богатого благодетеля своего, помещика Александра Соловцева, и заехали по дороге в Дивеево навестить настоятельницу общины Агафию Семёновну Мельгунову, высокочтимую всеми старицу и также благодетельницу свою. Мать Александра была больна и, получив от Господа извещение о скорой кончине своей, просила отцов-подвижников, ради любви Христовой, особоровать её. О. Пахомий сперва предлагал отложить елеосвящение до возвращения их из Лемети, но святая старица повторила свою просьбу и сказала, что они её не застанут уже в живых на обратном пути. Великие старцы с любовью совершили над нею таинство елеосвящения. Затем, прощаясь с ними, мать Александра отдала о. Пахомию последнее, что имела и накопила за года подвижнической жизни в Дивеево. По свидетельству жившей с нею девицы Евдокии Мартыновой своему духовнику, протоиерею о. Василию Садовскому, матушка Агафья Семёновна передала строителю о. Пахомию: мешочек золотом, мешочек серебром и два мешка меди, суммою в 40 тысяч, прося выдавать её сёстрам всё потребное в жизни, так как они сами не сумеют распорядиться. Матушка Александра умоляла о. Пахомия поминать её в Сарове за упокой, не оставлять и не покидать неопытных послушниц её, а также попещись в своё время об обители, обетованной ей Царицею Небесною. На это старец о. Пахомий ответил: «Матушка! Послужить по силе моей и по твоему завещанию Царице Небесной и попечением о твоих послушницах не отрекаюсь; также и молиться за тебя не только я до смерти моей буду, но и обитель вся наша никогда благодеяний твоих не забудет, а в прочем не даю тебе слово, ибо я стар и слаб, но как же и браться за то, не зная, доживу ли до этого времени. А вот иеродиакон Серафим — духовность его тебе известна, и он молод — доживёт до этого; ему и поручи это великое дело».
