Оптимальный режим работы прибора: встряхивание — 2 мин, время на расслаивание — 1 мин.
По заданным параметрам прибор работал автоматически. Когда завершался цикл (200 переносов) из каждой третьей ячейки отбиралось 3 мл верхней фазы и замерялась оптическая плотность раствора на спектрофотометре СФ-4А при длине волны 280 нм. По данным оптической плотности строили график распределения каннабиноидов и объединяли фракции.
Приводим результаты противоточного распределения 10 г суммы каннабиноидов. Вещества идентифицированы методом бумажном хроматографии и по ИК-спектрам (см. таблицу).
При меньших навесках происходит более четкое распределение, но наш опыт показывает, что таким путем можно проводить и препаративное получение каннабиноидов. При этом суммарные фракции следует использовать для разделения повторно.
5.5 Ионообменная хроматография
Известно, что иониты широко применяются в различных областях науки и производства. Обессоливание воды таким путем давно осуществляется в промышленных масштабах. Очистка медикаментов и, в частности, антибиотиков с помощью ионитов в ряде случаев выгоднее, чем другие способы. Особенно удобен этот метод для концентрирования веществ, находящихся в разбавленных растворах.
Нами были проведены эксперименты, при которых изучалась возможность разделения каннабиноидов с использованием ионообменной хроматографии.
После многочисленных опытов мы остановились на анионите отечественного производства АВ-17-8 в ОН-форме и определили оптимальные условия метода.
Использовалась колонка, где соотношение диаметра к высоте слоя анионита составило 1:10, а количество аннонита в 60 раз превышало количество разделяемых каннабиноидов. Скорость истечения — две капли в 1 сек.
Анионит сначала обрабатывался 5 %-ной соляной кислотой, затем водой и разбавленной щелочью до отрицательной реакции на ноны хлора. После этого смолу загружали в колонку и промывали метанолом.
Навеску экстракта из гашиша, предварительно очищенного через слой дезактивированной окиси алюминия, растворяли в небольшом объеме метанола, вносили в подготовленную колонку и промывали 0,1 н. метанольным раствором щелочи. Контроль за процессом разделения проводился методом бумажной хроматографии. По мере прохождения через колонку щелочного раствора анионит и элюат окрашивались в красно-фиолетовый цвет, что объясняется наличием КБД. По мере вытекания раствора окраска элюата бледнела, далее обнаруживалась примесь ТГК. Последующее промывание метанольной щелочью давало хроматографически чистый ТГК (элюат бесцветный), затем ТГК с примесью КБН и, наконец, чистый КБН. Для полного отделения КБН к концу опыта применялся более концентрированный раствор щелочи.
Промежуточные фракции хроматографировались повторно.
Элюаты далее подкислялись уксусной кислотой до pH 5–6, концентрировались, затем разбавлялись водой и экстрагировались бензолом. Полученные вещества хранились в бензольном растворе. При надобности растворы сушились сульфатом натрия и упаривались досуха.
Фенолокислоты остаются в верхней части колонки. Они могут быть выделены промыванием метиловым спиртом, подкисленным уксусной кислотой.
Одна порция анионита используется для разделении каннабиноидов многократно.
Эффективность ионообменного метода иллюстрируется выходами чистых компонентов (в % от суммарного экстракта, при однократном хроматографировании): КБД — 4, ТГК — 20, КБП — 7, КБДК — 23. Повторным разделением смешанных фракция выход чистых каннабиноидов удается значительно повысить.
Мы рекомендуем ионообменники для препаративного разделения экстракта гашиша. Масштабы одного опыта практически неограничены и зависят от размеров колонки, количества анионита и растворителя. Метанол однозначно заменим этанолом.
5.6 Получение каннабиноидов синтезом
КБН синтезируется сравнительно просто, но в этом нет необходимости ввиду незначительной его психотропной активности. КБД также синтезируется из доступных соединений, но в результате образуется смесь веществ, различающихся положением двойной связи в циклогексеновом кольце, и структурные изомеры. Получить сразу КБД со строго фиксированной кратной связью можно в виде метилового эфира, который, как известно, трудно поддается омылению. В жестких же условиях нет гарантии неизменности положения двойной связи.
Еще более сложная ситуация создастся при попытках синтеза ТГК определенной пространственной конфигурации. При синтезе образуется заведомая смесь оптических и геометрических изомеров.
Таким образом, процесс получения синтетического ТГК так же трудоемок, как и выделение его из конопли.
Однако при синтезе можно получить аналоги ТГК и других каннабиноидов, не встречающиеся в природе. Здесь открывается возможность расширить ассортимент психотропных соединении, что важно при изучении зависимости их физиологических свойств от тонких деталей строении молекул.
6. Физиологические свойства гашиша и каннабиноидов.
Вопросам изучения физиологии и токсикологии наркотических веществ конопли посвящена обширная литература, в нашем неполном обзоре она приводится выборочно.
Обобщить имеющийся материал оказалось трудно, прежде всего, потому, что гашиш представляет сложную и непостоянную по составу смесь разных соединений.
Во многих статьях описывают симптомы у людей и животных, находившихся под гашишным наркозом. Некоторые наблюдения были противоречивы и субъективны. Это не удивительно, так как в зависимости от качества гашиша, способа впадении в организм, продолжительности и кратности применения, наконец, от индивидуальных особенностей людей и подопытных животных, действие его варьирует от легкого опьянения до глубокого психического расстройства и токсикоза.
Животные и птицы по-разному реагируют на гашиш. У лягушек дым гашиша вызывает усиление рефлекторной деятельности, затем ослабление. У голубей и кур при этом наблюдалось возбуждение, сменяемое сонливостью. Мыши оказались особенно чувствительными к гашишу. Инъекция экстракта в количестве 1 мг на 1 кг веса вызывала резкое учащение дыхания, затем паралич.
Наиболее подходящими для фармакологического изучения гашиша и его компонентов оказались обезьяны и собаки, у которых внешние признаки отравления в какой-то мере такие же, как у человека. Предложены даже тесты для оценки эффективности действия образцов гашиша по характеру атаксии у собак, то есть расстройства координации произвольных движений. Атаксия обнаруживается уже в дозах около 10 мг гашиша на 1 кг веса животного.
В статье Яхимоглу описывается один из опытов: «Собаки становились удиви тельно спокойными, переставали бегать по клетке и лаять… При умеренных дозах впадали в гипнотическое состояние, теряли интерес к окружающим явлениям и как бы «боролись со сном». Поведение их можно сравнить с человеком, сидя засыпающим при длительной поездке в вагоне; голова медленно опускается, но при малейшем толчке он вздрагивает, открывает глаза и… снова впадает в дремоту. При больших дозах наркотическое состояние проявляется в утрате реакции на внешние раздражения. Если собаку поставить в необычную и даже неудобную позу, то она некоторое время остается в неизменном положении. При этом глаза собаки выражают безразличие и благодушие. В конце концов, она ложится и лишь ненадолго может подняться, если ее принуждает экспериментатор».
Наблюдения над обезьянами показали, что вскоре после введения наркотика у них отмечалось торможение. Еще несколько дней они выглядели как бы «сбитыми с толку», испытывали затруднение в произвольных движениях.
Анализируя литературные данные, некоторые авторы отмечают, что гашиш особенно сильно действует на животных с высокоорганизованной центральной нервной системой.
В целом результаты фармакологических исследований гашиша следует признать недостаточными и трудно сопоставимыми: в них, как правило, не указаны характеристика состава применяемого гашиша, способ приготовления экстрактов и не всегда учитывалась даже дозировка.
Находились
